AvrPiz-t中持有Inago2的solo-LTR毒性候选菌株的筛选方法技术

本发明专利技术属于分子生物学领域，具体涉及利用特异性引物对稻瘟病菌无毒基因AvrPiz‑t中插入Inago2反转座子的solo‑LTR片段的毒性菌株进行快速鉴定的引物和方法。本发明专利技术首次开发了一对特异的引物，该引物可以快速检测稻瘟病菌AvrPiz‑t基因启动子区是否插入了反转座子Inago2的solo‑LTR片段，从而为毒性候选菌株的快速筛选提供保障，为田间菌株的动态变化检测提供了技术支撑，为稻瘟病抗性育种及稻瘟病综合防控提供指导信息，也为开展稻瘟病致病机理研究提供素材。该引物特异性强，灵敏度高，可快速筛选出稻瘟病菌对IRBLzt‑T致病的毒性候选菌株，具有重要的科研和应用价值。

【技术实现步骤摘要】
AvrPiz-t中持有Inago2的solo-LTR毒性候选菌株的筛选方法
本专利技术属于分子生物学领域，具体涉及利用特异性引物对稻瘟病菌无毒基因AvrPiz-t是否插入Inago2反转座子的solo-LTR片段进行毒性菌株快速鉴定的方法。
技术介绍
稻瘟病是水稻生产上最具毁灭性的一种真菌病害。抗性基因(Resistancegene,R)的利用是控制稻瘟病最经济、生态友好的一种措施。然而由于稻瘟病菌(Magnaportheoryzae)的高度、快速变异使水稻抗性品种在种植3-5年后就“丧失”抗性。水稻抗性基因(Resistancegene,R)和稻瘟病菌无毒基因(Avirulancegene,Avr)互作符合Flor的基因对基因学说，即当两个基因同时存在才能相互作用引发水稻的抗性反应，反之缺少两者之中任何一个基因都不能引发水稻的免疫反应，水稻都感病。稻瘟病菌Piz-t基因是一个稻瘟病广谱抗性基因，是生产和育种上有较高利用价值的一个抗性基因，已于2006年克隆成功。相应的无毒基因AvrPiz-t也于2009年克隆成功。利用PCR扩增反应及测序技术检测稻瘟病菌菌株是否持有AvrPiz-t基因以及是否发生变异成为可能。稻瘟病菌无毒基因决定水稻中相应抗性基因的有效性。无毒基因的存在与否及变异都会影响抗性基因“丧失”。碱基在无毒基因的编码区、上游及下游的插入是无毒基因变异的一种方式。插入的碱基可以是转座子、反转座子、重复性DNA元件，也可以是单个碱基的插入。转座子是基因组中一段可移动的DNA序列，可以通过切割、重新整合等一系列过程从基因组的一个位置“跳跃”到另一个位置。它对基因的结构及功能具有很大的可塑性。目前已有相关报道表明转座子对稻瘟病菌无毒基因的功能转变发生作用。如：AVR-Pia侧翼转座子Pot3序列的插入及AVR-Pii侧翼Maggy的插入使病原菌在进化过程中具有很大的可塑性，导致无毒基因容易获得或丢失(Yoshidaetal.,2009)。PWL2基因旁侧序列中高拷贝或低拷贝的重复性DNA序列如MGR583、MGR586及MGR608(Hameretal.,1989)的变异导致PWL2的无毒功能丧失(Sweigardetal.,1995)。AVRPiz-t起始密码子上游462bp处Pot3转座子的插入使菌株Guy11变为毒性菌株(Lietal.,2009)。AVR-Pita的编码序列(Zhouetal.,2007)及5'端非编码序列插入了转座子Pot3(Daietal.,2010；Kangetal.,2001)导致无毒功能丧失。这些发现表明，在某些特定条件下，反向元件可以插入基因组，它们可能是植物病理学研究中克服病原体突变的靶标。鉴定新的反转录因子并研究它们的活性，将有助于阐明稻瘟病菌致病的本质，为稻瘟病的综合防控提供思路。Inago2是2011年在日本菌株9439009中新发现的散布于Magnaporthe基因组中的一种反转座子，属于逆转录转座Ty3/gypsy家族，该反转座子的活性仍属未知(Sanchez,Asano,&Sone,2011)。目前，专利技术人在云南的100个稻瘟病菌株中，发现1株菌株的无毒基因AvrPiz-t启动子区插入了198bp的Inago2的solo-LTR高度同源片段。致病性分析表明该菌株AvrPiz-t的变异能使持有Piz-t基因的近等基因系IRBLzt-T致病。这表明Inago2的solo-LTR片段的插入使稻瘟病菌无毒基因AvrPiz-t的毒性由无毒进化为有毒。这是有关该转座子部分元件插入致稻瘟病菌毒性功能发生变异的首次报道。致病位点的发现将会促进其它领域的发展，也使基因检测日趋成熟。常规确定毒性候选菌株的方法需要进行基因的PCR扩增及测序，然后与无毒基因的序列进行比对，继而选出变异菌株成为毒性候选菌株。毒性候选菌株最终都需要进行致病性测定来判断其毒性是否发生变异，若功能未发生变异，则为无毒菌株；反之则为毒性菌株。稻瘟病菌AvrPiz-t基因中插入反转座子Inago2的solo-LTR片段菌株可作为毒性候选菌株。本专利技术利用反转座子插入后菌株基因片段大小增加的特点设计一对引物既可扩增野生型基因也可扩增插入反转座子的突变基因。该专利技术只需通过PCR扩增后根据PCR产物的电泳结果就可判断该菌株是否为毒性候选菌株，减少了测序反应的时间及资金，使毒性菌株的基因检测技术日趋完善。该专利技术不仅为无毒基因AvrPiz-t和Piz-t基因互作及其致病机理研究提供材料，同时也可以快速掌握田间菌株的动态变化，为稻瘟病抗性育种及其综合防控提供指导信息。目前，还没有检索到关于AvrPiz-t中持有Inago2反转座子solo-LTR片段毒性菌株的筛选鉴定引物和方法的文献、引物或方法。参考文献Dai,Y.,Jia,Y.,Correll,J.,Wang,X.,&Wang,Y.(2010).DiversificationandevolutionoftheavirulencegeneAVR-Pita1infieldisolatesofMagnaportheoryzae.FungalGenetics&Biology,47(12),973-980.Hamer,J.E.,Farrall,L.,Orbach,M.J.,Valent,B.,&Chumley,F.G.(1989).Hostspecies-specificconservationofafamilyofrepeatedDNAsequencesinthegenomeofafungalplantpathogen.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,86(24),9981-9985.Kang,S.,Lebrun,M.H.,Farrall,L.,&Valent,B.(2001).GainofvirulencecausedbyinsertionofaPot3transposoninaMagnaporthegriseaavirulencegene.MolecularPlantMicrobeInteract,14(5),671-674.Li,W.,Wang,B.,Wu,J.,Lu,G.,Hu,Y.,Zhang,X.,...Wang,Z.(2009).TheMagnaportheoryzaeavirulencegeneAvrPiz-tencodesapredictedsecretedproteinthattriggerstheimmunityinricemediatedbytheblastresistancegenePiz-t.MolecularPlantMicrobeInteract,22(4),411-420.Sanchez,E.,Asano,K.,&Sone,T.(2011).CharacterizationofInago1andInago2retrotransposonsinMagnaporth本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.AvrPiz-t中持有Inago2反转座子solo-LTR片段毒性菌株的筛选鉴定的引物，其特征在于：所述的引物序列：/nInago2-F1：5‘-TGGAGTTATCCTCGACAC-3’/nInago2-R1：5‘-CCGAATTCCAGCCGAAGATAC-3’。/n

【技术特征摘要】
1.AvrPiz-t中持有Inago2反转座子solo-LTR片段毒性菌株的筛选鉴定的引物，其特征在于：所述的引物序列：
Inago2-F1：5‘-TGGAGTTATCCTCGACAC-3’
Inago2-R1：5‘-CCGAATTCCAGCCGAAGATAC-3’。


2.根据权利要求1所述的引物进行AvrPiz-t中持有Inago2反转座子solo-LTR片段毒性菌株的筛选鉴定的方法，包括以下步骤：
S1：待测样菌株总DNA提取；
S2:以步骤(1)中得到的样品DNA为模板，构建专用PCR反应体系，利用权利要求1所述特异性引物进行PCR扩增；
S3:利用琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增产物进行检测，当PCR产物为800bp时，该稻瘟病菌菌株发生了变异，即稻瘟病菌菌株插入反转座子的solo-LTR片段；当PCR产物为600bp时，该稻瘟病菌菌株...

【专利技术属性】
技术研发人员：李进斌，王群，陆琳，何成兴，
申请(专利权)人：云南省农业科学院农业环境资源研究所，
类型：发明
国别省市：云南;53