用于HLA-B1502和HLA-A2402基因型检测的试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及用于HLA‑B*15:02和HLA‑A*24:02基因型检测的试剂盒，所述试剂盒是多重PCR扩增试剂盒，其包括针对HLA‑B*15:02和HLA‑A*24:02每个基因型的上游引物、上游封闭引物以及下游引物、下游封闭引物，本发明专利技术试剂盒在一管中同时检测HLA‑B*15:02和HLA‑A*24:02基因亚型，提高了多重PCR扩增的效率，检测灵敏度和检测特异性，并且较常规的单链引物多重扩增的荧光定量PCR方法显著性减少了假阳性的结果。

【技术实现步骤摘要】
用于HLA-B1502和HLA-A2402基因型检测的试剂盒
本专利技术涉及分子诊断领域，特别涉及用于HLA-B*15:02和HLA-A*24:02基因型检测的试剂盒。
技术介绍
癫痫是神经科第二常见疾病，我国癫痫患者过千万，每年新增约40万，药物治疗为癫痫的主要治疗方式，多数患者需要长期服药，但大约16％的患者出现皮肤型过敏反应，包括轻度的斑丘疹(maculopapularexanthema,MPE)及重度的斯蒂文森-强生综合症(Stevens-Johnsonsyndrome，SJS)和中毒性表皮坏死松解症(toxicepidermalnecrolysis，TEN)，明显影响生活质量，严重时出现剥脱性皮炎，通常全身粘膜(眼、嘴、生殖器)溃疡，皮肤起水疱，甚至出现全身表皮脱离，如同大面积烫伤，致死性高达40％。这种过敏在南方汉族人群，尤其是在广东及周边地区的汉族人群中发病率明显高于其它地区及人群。卡马西平(CBZ)、拉莫三嗪(LTG)、奥卡西平(OXC)、苯妥英钠(PHT)以及妥泰(PB)都具有相似的芳香族结构，是广泛使用的用于控制癫痫、三叉神经痛等的抗癫痫药物(AEDs)。然而，该类药物通常会导致皮肤不良反应(cADRs)，长期困扰着临床医生。cADRs占所有报道的药物不良反应的10％-30％，包括轻度的斑丘疹(MPE)、药物超敏反应综合症(HSS)到重型的有潜在致命性的Stevens-Johnson综合症(SJS)和/或中毒性表皮坏死松解症(Toxicepidermalnecrolysis,TEN)。如能找到与其相关的基因标志，将对临床用药起到很大的指导作用。人类白细胞抗原(HLA)基因与人体免疫相关，包括数千个不同的基因型。HLA-B*15:02为我国南方汉族人群卡马西平导致剥脱性皮炎的遗传标记，HLA-A*24:02是卡马西平导致剥脱性皮炎的新的风险基因，两位点同时检测将卡马西平导致剥脱性皮炎的排除概率从69.6％提高到90％。两位点同时阳性时，芳香族抗癫痫药物引起的严重皮肤过敏风险值增大23倍。因此癫痫患者用药前通过这两个基因型筛查可降低甚至避免致死性皮肤型不良反应的发生。HLA基因的不同基因亚型序列同源性高，因此一般多通过测序的方法来区分HLA基因的不同基因亚型；但测序的方法成本较高，实验周期较长，难以满足临床诊断的需求。而基于荧光定量PCR方法来检测HLA基因的不同基因亚型，由于序列同源性高的原因，经常会导致检测的假阳性。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术提供一种用于HLA-B*15:02和HLA-A*24:02基因型检测的试剂盒，所述试剂盒是多重PCR扩增试剂盒，其包括针对HLA-B*15:02和HLA-A*24:02每个基因型的上游引物、上游封闭引物以及下游引物、下游封闭引物，其中每个上游引物一端包括至少3个连续人工设计的碱基不与待扩增靶序列互补，每个上游封闭引物一端包括与所述至少3个连续人工设计的碱基互补的碱基，每个上游引物和每个上游封闭引物连续互补碱基的数目比每个上游引物和待扩增靶序列连续互补碱基的数目至少少2个碱基；和每个下游引物一端包括至少3个连续人工设计的碱基不与待扩增靶序列互补，每个下游封闭引物一端包括与所述至少3个连续人工设计的碱基互补的碱基，每个下游引物和每个下游封闭引物连续互补碱基的数目比每个下游引物和待扩增靶序列连续互补碱基的数目至少少2个碱基。在一种实施方式中，每个上游引物一端包括4个连续人工设计的碱基不与待扩增靶序列互补，在该端所述上游引物与所述上游封闭引物互补；在每个上游引物另一端，每个上游引物与所述待扩增靶序列连续互补碱基的数目比每个上游引物与所述上游封闭引物连续互补碱基的数目多6个；和，每个下游引物一端包括4个连续人工设计的碱基不与待扩增靶序列互补，在该端所述下游引物与所述下游封闭引物互补；在每个下游引物另一端，每个下游引物与所述待扩增靶序列连续互补碱基的数目比每个下游引物与所述下游封闭引物连续互补碱基的数目多6个。在一种实施方式中，每个上游引物一端包括4个连续人工设计的碱基不与待扩增靶序列互补，在该端所述上游引物与所述上游封闭引物互补；在每个上游引物另一端，每个上游引物与所述待扩增靶序列连续互补碱基的数目比每个上游引物与所述上游封闭引物连续互补碱基的数目多7个；和，每个下游引物一端包括4个连续人工设计的碱基不与待扩增靶序列互补，在该端所述下游引物与所述下游封闭引物互补；在每个下游引物另一端，每个下游引物与所述待扩增靶序列连续互补碱基的数目比每个下游引物与所述下游封闭引物连续互补碱基的数目多7个。在一种实施方式中，每个上游引物一端包括5个连续人工设计的碱基不与待扩增靶序列互补，在该端所述上游引物与所述上游封闭引物互补；在每个上游引物另一端，每个上游引物与所述待扩增靶序列连续互补碱基的数目比每个上游引物与所述上游封闭引物连续互补碱基的数目多7个；和，每个下游引物一端包括5个连续人工设计的碱基不与待扩增靶序列互补，在该端所述下游引物与所述下游封闭引物互补；在每个下游引物另一端，每个下游引物与所述待扩增靶序列连续互补碱基的数目比每个下游引物与所述下游封闭引物连续互补碱基的数目多7个。在一种实施方式中，针对HLA-A*24:02基因型的上游引物是SEQIDNO:2：GAGAC-GGAGTATTGGGACGAG-GAGACAG，上游封闭引物是SEQIDNO:3：CTCGTCCCAATACTCC-GTCTC，下游引物是SEQIDNO:5：CAGGT-GAGCGCGATC-CCAGGTT，下游封闭引物是GATCGCGCTC-ACCTG(SEQIDNO:6)；和，针对HLA-B*15:0基因型的上游引物是SEQIDNO:9:GATGG-GCGAGTCCG-AGATGGC，上游封闭引物是SEQIDNO:10:CGGACTCGC-CCATC，下游引物是SEQIDNO:12:TCTTG-GTAAGTCTGTGTGTTG-GTCTTGG，下游封闭引物SEQIDNO:13:CAACACACAGACTTAC-CAAGA。在一种实施方式中，针对HLA-A*24:02基因型的探针序列是SEQIDNO:7:GACAGGGAAAGTGAAGG-BHQ1，和针对HLA-B*15:0基因型的探针序列是SEQIDNO:14:AGATCTGTGTGTTCCGGTCCCAA-BHQ1()，上述二个探针5’端标记不同的荧光。在本专利技术多重PCR反应中利用具有封闭非特异性反应的封闭引物，降低了非特异反应，从而提高了多重PCR反应的灵敏度和提高了多重PCR扩增反应的扩增效率。相应地，使得本专利技术的qPCR扩增体系的特异性得到了明显的改善，提高了试剂盒检测的准确率，减少了假阳性发生。附图说明为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。图1是本发本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于HLA-B*15:02和HLA-A*24:02基因型检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒是多重PCR扩增试剂盒，其包括针对HLA-B*15:02和HLA-A*24:02每个基因型的上游引物、上游封闭引物以及下游引物、下游封闭引物，/n其中每个上游引物一端包括至少3个连续人工设计的碱基不与待扩增靶序列互补，每个上游封闭引物一端包括与所述至少3个连续人工设计的碱基互补的碱基，每个上游引物和每个上游封闭引物连续互补碱基的数目比每个上游引物和待扩增靶序列连续互补碱基的数目至少少2个碱基；和/n每个下游引物一端包括至少3个连续人工设计的碱基不与待扩增靶序列互补，每个下游封闭引物一端包括与所述至少3个连续人工设计的碱基互补的碱基，每个下游引物和每个下游封闭引物连续互补碱基的数目比每个下游引物和待扩增靶序列连续互补碱基的数目至少少2个碱基。/n

【技术特征摘要】
1.用于HLA-B*15:02和HLA-A*24:02基因型检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒是多重PCR扩增试剂盒，其包括针对HLA-B*15:02和HLA-A*24:02每个基因型的上游引物、上游封闭引物以及下游引物、下游封闭引物，
其中每个上游引物一端包括至少3个连续人工设计的碱基不与待扩增靶序列互补，每个上游封闭引物一端包括与所述至少3个连续人工设计的碱基互补的碱基，每个上游引物和每个上游封闭引物连续互补碱基的数目比每个上游引物和待扩增靶序列连续互补碱基的数目至少少2个碱基；和
每个下游引物一端包括至少3个连续人工设计的碱基不与待扩增靶序列互补，每个下游封闭引物一端包括与所述至少3个连续人工设计的碱基互补的碱基，每个下游引物和每个下游封闭引物连续互补碱基的数目比每个下游引物和待扩增靶序列连续互补碱基的数目至少少2个碱基。


2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，每个上游引物一端包括4个连续人工设计的碱基不与待扩增靶序列互补，在该端所述上游引物与所述上游封闭引物互补；在每个上游引物另一端，每个上游引物与所述待扩增靶序列连续互补碱基的数目比每个上游引物与所述上游封闭引物连续互补碱基的数目多6个；和，
每个下游引物一端包括4个连续人工设计的碱基不与待扩增靶序列互补，在该端所述下游引物与所述下游封闭引物互补；在每个下游引物另一端，每个下游引物与所述待扩增靶序列连续互补碱基的数目比每个下游引物与所述下游封闭引物连续互补碱基的数目多6个。


3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，每个上游引物一端包括4个连续人工设计的碱基不与待扩增靶序列互补，在该端所述上游引物与所述上游封闭引物互补；在每个上游引物另一端，每个上游引物与所述待扩增靶序列连续互补碱基的数目比每个上游引物与所述上游封闭引物连续互补碱基的数目多7个；和，
每个下游引物一端包括4个连续人工设计的碱基不与待扩增靶序列互补，在该端所述下游引物与所述下游封闭引物互补；在每个下游引物另一端，每个下游引物与所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：石奕武，廖卫平，
申请(专利权)人：广州医科大学附属第二医院，
类型：发明
国别省市：广东;44