本发明专利技术涉及基因工程领域，具体而言，提供了一种特异性识别猪COL1A1基因的gRNA及其生物材料、试剂盒和应用。特异性识别猪COL1A1基因的gRNA中负责识别靶片段区域的核苷酸序列为SEQ IDNO.1所示序列，本发明专利技术提供的gRNA能够识别猪COL1A1基因编码区下游如SEQ ID NO.5所示的靶序列。通过所述gRNA的介导，能够使Cas9靶向猪基因组上COL1A1基因的第51个外显子末端产生双链断裂，切割效率可达22％，进而实现对COL1A1基因进行编辑，如氨基酸的修饰、替换，或者在该位点插入外源基因表达框，实现外源基因的稳定、高效表达。
【技术实现步骤摘要】
特异性识别猪COL1A1基因的gRNA及其生物材料、试剂盒和应用
本专利技术涉及基因工程领域，具体而言，涉及一种特异性识别猪COL1A1基因的gRNA及其生物材料、试剂盒和应用。
技术介绍
COL1A1基因编码I型胶原蛋白a1链，位于猪的12号染色体上，基因全长18094bp。胶原蛋白是细胞外基质的主要成分，是人体内最丰富的蛋白质，维持着组织和器官的完整结构，并与人体早期发育、器官形成、细胞间的连接、细胞趋化、血小板凝集以及膜的通透性等功能密切相关。胶原蛋白家族包括19种胶原蛋白及10种以上胶原样蛋白，由至少30种不同的基因编码。其中I型胶原在人体胶原中含量最丰富，I胶原蛋白一开始是由两个α1链-COL1A1基因编码，和一个前α2链-由COL1A2基因编码组成。I型胶原是动物身体中最丰富且表达最广泛的蛋白质。它是皮肤、骨、肌腱、韧带、血管、牙质和许多间质组织的主要组成成分。因此将外源基因定点整合到COL1A1基因第51个外显子的末端，不仅有助于深入研究COL1A1基因功能和蛋白定位，还可以在该位点形成一个友好基因座，极大的方便外源基因在多个组织的高效、稳定表达。因此，对猪COL1A1基因的高效编辑对进一步研究猪COL1A1基因，以及实现外源基因的稳定、高效表达具有重要意义。有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的第一目的在于提供一种特异性识别猪COL1A1基因的gRNA。本专利技术的第二目的在于提供与gRNA相关的生物材料。本专利技术的第三目的在于提供一种试剂盒。本专利技术的第四目的在于提供对猪基因组中COL1A1基因进行基因编辑的方法。本专利技术的第五目的在于提供gRNA、生物材料、试剂盒或方法在定点整合外源基因中的应用。本专利技术的第六目的在于提供一种在猪基因组中定点整合外源基因的方法。为了实现本专利技术的上述目的，特采用以下技术方案：一种特异性识别猪COL1A1基因的gRNA，所述gRNA中负责识别靶片段区域的核苷酸序列为SEQIDNO.1所示序列。与上述gRNA相关的生物材料，包括：(a)编码权利要求1所述的gRNA的DNA分子；(b)表达盒，包括(a)中的DNA分子；(c)表达载体，包括(a)中的DNA分子或(b)中的表达盒。进一步地，所述(a)中的DNA分子序列如SEQIDNO.2所示。进一步地，所述(b)中的表达盒还包括编码Cas9的DNA分子。试剂盒，包括上述的gRNA或生物材料。对猪基因组中COL1A1基因进行基因编辑的方法，在猪源生物材料中，利用上述的gRNA介导Cas9对猪COL1A1基因进行基因编辑。进一步地，所述方法包括将基因编辑元件导入猪源生物材料中，所述基因编辑元件包括如下(a)或(b)：(a)所述gRNA或编码所述gRNA的DNA分子；和Cas9相关元件，所述Cas9相关元件包括编码Cas9的DNA、编码Cas9的mRNA或Cas9蛋白分子；(b)同时编码所述gRNA和Cas9的表达载体；优选地，所述猪源生物材料包括猪体细胞或猪受精卵；优选地，所述猪体细胞包括猪成纤维细胞；优选地，采用磷酸钙法、脂质转染法、慢病毒转染法或电穿孔法将所述基因编辑元件导入猪体细胞，优选采用电穿孔法；优选地，采用受精卵显微注射法将所述基因编辑元件导入猪受精卵。上述的gRNA、生物材料、试剂盒或方法在定点整合外源基因中的应用。一种在猪基因组中定点整合外源基因的方法，包括将上述的gRNA或生物材料导入猪源生物材料中。进一步地，所述方法包括将基因编辑元件导入猪受精卵，以获得经COL1A1基因编辑的胚胎；或，所述方法包括将基因编辑元件导入猪体细胞，筛选出COL1A1基因编辑阳性的体细胞，然后通过体细胞核移植来构建重构胚胎；所述体细胞优选地包括成纤维细胞；优选地，所述筛选包括使用引物对对导入基因编辑元件的体细胞进行PCR鉴定；所述引物对的上游引物和下游引物分别位于整合位点的上游和下游；所述引物对扩增产物长度为247bp时无外源基因定点插入，所述引物对扩增产物长度大于247bp时为所述COL1A1基因位点定点整合外源基因的编辑阳性体细胞；优选地，所述引物对序列如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示。与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：本专利技术提供的特异性识别猪COL1A1基因的gRNA，负责识别靶片段区域的核苷酸序列为SEQIDNO.1所示序列，本专利技术提供的gRNA能够识别猪COL1A1基因编码区下游如SEQIDNO.5所示的靶序列。通过所述gRNA的介导，能够使Cas9靶向猪基因组上COL1A1基因的第51个外显子末端产生双链断裂，切割效率可达22％，进而实现对COL1A1基因进行编辑，如氨基酸的修饰、替换，或者在该位点插入外源基因表达框，实现外源基因的稳定、高效表达。附图说明为了更清楚地说明本专利技术具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本专利技术的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为本专利技术实施例1中gRNA效率检测PCR产物直接测序峰图；图2为本专利技术实施例1中gRNA效率检测T7E1酶切图；图3为本专利技术实施例2中利用识别猪COL1A1基因的gRNA，Cas9蛋白以及携带外源基因的Donor载体实现外源基因定点整合的示意图；图4为本专利技术实施例2中对转染gRNA，Cas9蛋白以及携带外源基因的Donor载体后的PEF细胞进行流式分选，检测GFP阳性细胞的比例；图5为本专利技术实施例2中对流式分选到的GFP阳性PEF细胞进行junctionPCR检测。M泳道代表DNAmarker；S泳道代表流式分选后的GFP阳性PEF细胞；N泳道代表野生型PEF细胞。具体实施方式下面将结合实施例对本专利技术的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本专利技术，而不应视为限制本专利技术的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。除非另有说明，本文中所用的专业与科学术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法或材料也可应用于本专利技术中。gRNA为向导RNA，是CRISPR基因敲除敲入系统中重要的组成部分，与Cas9蛋白结合，引导Cas9酶靶向基因组DNA进行剪切。本专利技术提供的特异性识别猪COL1A1基因的gRNA，其中负责识别靶片段区域的核苷酸序列为GAAACUCCCUCCGCCCCAAUC(SEQIDNO.1)所示序列。该gRNA能够将猪COL1A1基因编码区下游的一段序列作为靶序列，该靶序列如ACCAAGAATTCGGCATCGACCTTAGCCCTGTCTGCTTCCTGTAAACT本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种特异性识别猪COL1A1基因的gRNA，其特征在于，所述gRNA中负责识别靶片段区域的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示序列。/n
【技术特征摘要】
20200629 CN 20201061599621.一种特异性识别猪COL1A1基因的gRNA，其特征在于，所述gRNA中负责识别靶片段区域的核苷酸序列为SEQIDNO.1所示序列。
2.与权利要求1所述gRNA相关的生物材料，其特征在于，包括：
(a)编码权利要求1所述的gRNA的DNA分子；
(b)表达盒，包括(a)中的DNA分子；
(c)表达载体，包括(a)中的DNA分子或(b)中的表达盒。
3.根据权利要求2所述的生物材料，其特征在于，所述(a)中的DNA分子序列如SEQIDNO.2所示。
4.根据权利要求2所述的生物材料，其特征在于，所述(b)中的表达盒还包括编码Cas9的DNA分子。
5.试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的gRNA或权利要求2-4任一项所述的生物材料。
6.对猪基因组中COL1A1基因进行基因编辑的方法，其特征在于，在猪源生物材料中，利用权利要求1所述的gRNA介导Cas9对猪COL1A1基因进行基因编辑。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法包括将基因编辑元件导入猪源生物材料中，所述基因编辑元件包括如下(a)或(b)：
(a)所述gRNA或编码所述gRNA的DNA分子；和Cas9相关元件，所述Cas9相关元件包括编码Cas9的DNA、编码Cas9的mRNA或Cas9蛋白分子...
【专利技术属性】
技术研发人员：李奎，牟玉莲，刘志国，樊自尧，向光明，
申请(专利权)人：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11
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