一种口腔鳞癌类器官培养基以及培养方法技术

本发明专利技术公开了一种口腔鳞癌类器官的培养方法，包括以下步骤：S1、解离酶配置；S2、配置培养基，培养基由基础培养基DMEM/F12、R‑spondin1条件培养基、Wnt3A条件培养基、无菌水和功能组分组成；S3、临床操作获取样品，通过取材或手术切除获得肿瘤标本，切取组织，用无菌生理盐水冲洗3次，将组织放入DMEM培养基中浸泡1小时，继续解离；S4、组织预处理：将步骤S3中获得的样品置于无菌6孔板中，用一次性无菌手术刀片将样品组织块切碎；S5、组织解离消化：加入步骤S1中配好的解离酶，重复离心‑去除上清这一过程3次以充分去除解离酶，最后一次离心前将细胞与样品组织块混合；S6、类器官培养。

【技术实现步骤摘要】
一种口腔鳞癌类器官培养基以及培养方法
本专利技术涉及生物医药
，更具体地说，涉及一种口腔鳞癌类器官培养基以及培养方法。
技术介绍
口腔鳞状细胞癌(OralSquamousCellCarcinoma,OSCC)是口腔颌面部最常见的恶性肿瘤，2020年全球OSCC年新发病例约37.77万，死亡17.78万，其5年生存率仅60％左右。对于中晚期尤其是复发/转移性的OSCC患者，化疗辅助下的综合治疗是标准化的治疗方案，例如顺铂和紫杉醇是一线化疗用药，但治疗效果并不尽如人意，而靶向治疗药物对OSCC的治疗效果也有待进一步验证，因此，目前急需开发出更为有效的个体化精准治疗方案。同时，肿瘤类器官(tumororganoid)模型能够很好地预测原位肿瘤的药物敏感性；类器官(organoid)是一种能够自发组织、3D培养的体外细胞模型；类器官能够模拟体内器官的微观结构和功能，类器官由多能干细胞或成体干细胞在多种复杂的细胞因子诱导下发育而来；肿瘤类器官，是利用体外培养类器官的方法来培养原代肿瘤细胞；肿瘤类器官能够维持肿瘤在体内生长的形态，其基因表达谱与体内肿瘤相似性约90％；肿瘤类器官不仅能够保留原发肿瘤的特点，保持不同病人肿瘤之间的差异性，而且能够保持同一个病人原发肿瘤内肿瘤细胞的异质性。此外，肿瘤类器官还能准确地预测原发肿瘤的药物敏感性，为未来个体化治疗提供参考。更重要的是，肿瘤类器官的建立只需一周时间，药物敏感性实验也仅需10天，具有极强的临床时效性，是未来进行肿瘤临床药物筛选的最佳选择。然而，口腔鳞癌与其他肿瘤相比培养难度在于，一方面口腔鳞癌处于带菌环境，类器官出现细菌、支原体乃至真菌污染的风险较高；另一方面口腔鳞癌病理类型以中高分化为主，高分化肿瘤细胞角化程度较好，肿瘤干性较低，构建类器官对比其他低分化肿瘤存在更高难度，口腔鳞癌类器官生长缓慢且培养成功率较低。
技术实现思路
本专利技术旨在提供一种口腔鳞癌类器官培养基以及培养方法，旨在解决现有技术中口腔鳞癌类器官培养中污染比例较高、培养成功率低及生长缓慢的问题。为实现此目的，本专利技术提供了一种口腔鳞癌类器官培养基，由基础培养基DMEM/F12、R-spondin1条件培养基、Wnt3A条件培养基、无菌水和功能组分组成，所述功能组分在该类器官培养基中的终浓度组成为：HEPES，8-12mmol/L；Glutamax0.8-1.2×；A83-01，400-600nmol/L；EGF，35-60ng/mL；Noggin，80-120ng/mL；FGF10，8-12ng/mL；GastrinI，0.01μmol/L；N-acetylcysteine，1-1.5mmol/L；nicotinamide，8-12mmol/L；PGE2，0.8-1.2μmol/L；Butylatedhydroxyanisole，4-10ng/ml；青霉素-链霉素-两性霉素B混合溶液0.8-1.2X；B27supplement；ProstaglandinE2，0.8-1.2umol/L；且R-spondin1条件培养基占总体积的10％，Wnt3A条件培养基占总体积的50％优选的，由基础培养基DMEM/F12、R-spondin1条件培养基、Wnt3A条件培养基、无菌水和功能组分组成，所述功能组分在该类器官培养基中的终浓度组成为：HEPES，10mmol/L；Glutamax1×；A83-01，500nmol/L；EGF，50ng/mL；Noggin，100ng/mL；FGF10，10ng/mL；GastrinI，0.01μmol/L；N-acetylcysteine，1.25mmol/L；nicotinamide，10mmol/L；PGE2，1μmol/L；Butylatedhydroxyanisole，5ng/ml；青霉素-链霉素-两性霉素B混合溶液1X；B27supplement；ProstaglandinE2，1umol/L；且R-spondin1条件培养基占总体积的10％，Wnt3A条件培养基占总体积的50％本专利技术还提供了一种口腔鳞癌类器官的培养方法，包括以下步骤：S1、解离酶配置：5mg/ml的胶原酶I和10ug/ml的DNA酶I以无血清DMEM培养基为溶剂配置；S2、配置上述培养基；S3、临床操作获取样品：通过取材或手术切除获得肿瘤标本，切取0.5cm×0.5cm×0.5cm组织，用无菌生理盐水冲洗3次，将组织放入含有20％双抗的预冷的DMEM培养基中浸泡1小时，继续解离，全程冰上保存运输；S4、组织预处理：将步骤S3中获得的样品置于无菌6孔板中，用一次性无菌手术刀片将样品组织块切碎；S5、组织解离消化：加入3ml步骤S1中配好的解离酶，将样品组织块移至15ml离心管中，在37度的温度下，以转速140rpm于恒温摇床中震荡消化10分钟；将已消化的上清转移到新的15ml离心管中，冰上保存；在剩余样品组织块沉淀内再加入3ml解离酶，继续在37度温度下以转速140rpm消化10分钟；重复上一操作，共计分3次消化，每次加入3ml解离酶；将消化好的组织和消化液的混合溶液分为2管，并在4度温度下以1400rpm离心5分钟，离心后去掉上清，并加入5mlDMEM培养基，重复离心-去除上清这一过程3次以充分去除解离酶，最后一次离心前将细胞与样品组织块混合；S6、类器官培养：在细胞沉淀中先加入50ul步骤S2中获得的培养基，将细胞吹匀，后加入基质胶600ul，用截断枪头轻柔吹打沉淀细胞团使其重悬；充分混匀后，将混有基质胶的细胞团分别均匀点入6孔板中，每孔约4-5个液滴，彼此分散间隔；放入细胞培养箱中10分钟待基质胶充分凝固，基质胶凝固后，加入步骤S2中的培养基2ml，使得液面没过基质胶，每3天换一次新鲜培养基，培养3天后，获得口腔鳞癌类器官。优选的，所述基质胶为Matrigel。优选的，S1中所述的解离酶在4度的温度下保存。相比于现有技术，本专利技术的优点在于：采用本专利技术的口腔鳞癌类器官培养基，使得口腔鳞癌类器官培养中受到污染的比例大大降低，提高了工作效率且适用范围广；采用本专利技术的口腔鳞癌类器官培养方法，加强了类器官培养前的组织预处理，使得口腔鳞癌类器官生长迅速且培养成功率大大提高。附图说明图1为本专利技术的颊鳞癌类器官在显微镜下的细胞形态学观察图；图2为本专利技术的舌鳞癌类器官在显微镜下的细胞形态学观察图。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述；显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。本专利技术实施例采用的EGF、FGF10、GastrinI、N-acetylcysteine、R-spondin1conditionedmedia、Wnt3Acond本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种口腔鳞癌类器官培养基，其特征在于：由基础培养基DMEM/F12、R-spondin1条件培养基、Wnt3A条件培养基、无菌水和功能组分组成，所述功能组分在该类器官培养基中的终浓度组成为：HEPES，8-12mmol/L；Glutamax 0.8-1.2×；A83-01，400-600nmol/L；EGF，35-60ng/mL；Noggin，80-120ng/mL；FGF10，8-12ng/mL；Gastrin I，0.01μmol/L；N-acetylcysteine，1-1.5mmol/L；nicotinamide，8-12mmol/L；PGE2，0.8-1.2μmol/L；Butylated hydroxyanisole，4-10ng/ml；青霉素-链霉素-两性霉素B混合溶液0.8-1.2X；B27 supplement；Prostaglandin E2，0.8-1.2umol/L；且R-spondin1条件培养基占总体积的10％，Wnt3A条件培养基占总体积的50％。/n

【技术特征摘要】
1.一种口腔鳞癌类器官培养基，其特征在于：由基础培养基DMEM/F12、R-spondin1条件培养基、Wnt3A条件培养基、无菌水和功能组分组成，所述功能组分在该类器官培养基中的终浓度组成为：HEPES，8-12mmol/L；Glutamax0.8-1.2×；A83-01，400-600nmol/L；EGF，35-60ng/mL；Noggin，80-120ng/mL；FGF10，8-12ng/mL；GastrinI，0.01μmol/L；N-acetylcysteine，1-1.5mmol/L；nicotinamide，8-12mmol/L；PGE2，0.8-1.2μmol/L；Butylatedhydroxyanisole，4-10ng/ml；青霉素-链霉素-两性霉素B混合溶液0.8-1.2X；B27supplement；ProstaglandinE2，0.8-1.2umol/L；且R-spondin1条件培养基占总体积的10％，Wnt3A条件培养基占总体积的50％。


2.根据权利要求1所述的口腔鳞癌类器官培养基，其特征在于：由基础培养基DMEM/F12、R-spondin1条件培养基、Wnt3A条件培养基、无菌水和功能组分组成，所述功能组分在该类器官培养基中的终浓度组成为：HEPES，10mmol/L；Glutamax1×；A83-01，500nmol/L；EGF，50ng/mL；Noggin，100ng/mL；FGF10，10ng/mL；GastrinI，0.01μmol/L；N-acetylcysteine，1.25mmol/L；nicotinamide，10mmol/L；PGE2，1μmol/L；Butylatedhydroxyanisole，5ng/ml；青霉素-链霉素-两性霉素B混合溶液1X；B27supplement；ProstaglandinE2，1umol/L；且R-spondin1条件培养基占总体积的10％，Wnt3A条件培养基占总体积的50％。


3.一种口腔鳞癌类器官的...

【专利技术属性】
技术研发人员：章茜，王育新，胡勤刚，
申请(专利权)人：南京市口腔医院，
类型：发明
国别省市：江苏;32