猪圆环病毒2型感染PK-15细胞产生的外泌体分离与检测方法技术

本发明专利技术公开了猪圆环病毒2型感染PK‑15细胞产生的外泌体分离与检测方法，属于生物检测技术领域。本发明专利技术的外泌体分离纯化方法，依次包括下列步骤：（1）细胞上清液低速离心去除细胞和细胞碎片，高速离心去除大膜泡；（2）再将细胞上清液与聚合物混合孵育，高速离心后得到外泌体粗提物；（3）将外泌体粗提物进行蔗糖密度梯度离心后得到外泌体。本发明专利技术提取的外泌体中不含PCV2粒子，本发明专利技术可用于纯化和检测PCV2感染PK‑15细胞后产生外泌体，为研究外泌体在病毒感染中的作用奠定基础。

【技术实现步骤摘要】
猪圆环病毒2型感染PK-15细胞产生的外泌体分离与检测方法
本专利技术属于生物检测
，涉及细胞上清液中外泌体的提取分离，具体是涉及猪圆环病毒2型感染PK-15细胞产生的外泌体分离与检测方法。
技术介绍
猪圆环病毒2型(Porcinecircovirustype2,PCV2)特征是病毒粒子无囊膜，基因组为环状、闭合、单股的DNA，直径17～20nm，呈二十面体对称结构，PCV2粒子在CsCL中的浮密度为1.37g·cm-3，沉降系数为52S。PCV2基因组含有11个潜在开放阅读框(ORF)即ORF1～11，其中ORF1编码病毒复制相关蛋白(Rep和Rep')，ORF2编码病毒的主要结构蛋白Cap蛋白；PCV2感染可引起机体免疫抑制，导致机体免疫平衡紊乱，易于感染其他疾病。PCV2造成猪脾脏淋巴细胞减少引起猪免疫抑制，但PCV2对淋巴细胞感染率低，当巨噬细胞与淋巴细胞共培养时，PCV2对淋巴细胞感染率提高。外泌体(Exosome)是由活细胞分泌的直径约为30-150nm、浮密度为1.13-1.19g·mL-1的小囊泡，具有典型的脂质双分子层结构；存在于细胞培养上清液、血清、血浆、唾液、尿液、羊水以及其它生物体液中；外泌体携带有多种蛋白质、脂类、RNA等重要信息，不仅在细胞与细胞间的物质和信息传递中起重要作用，更有望成为多种疾病的早期诊断标志物。外泌体独特的结构，以及临床应用的良好前景，使得外泌体成了人们研究的热点。许多病毒感染的细胞分泌的外泌体与正常细胞分泌的外体含量不同，它们也可能包含各种病毒蛋白、RNAs，甚至病毒粒子，因此病毒有可能利用外泌体进行传播并感染靶细胞。外泌体的分离方法通常包括超速离心法、密度梯度离心、亲和层析分离法、免疫磁珠分离法以及聚合物沉淀等方法，但这些提取方法都有一些优缺点，如：超离法因操作简单，获得的囊泡数量较多而广受欢迎，但过程比较费时，且回收率不稳定，纯度也受到质疑；此外，重复离心操作还有可能对囊泡造成损害，从而降低其质量。密度梯度离心法获得的外泌体纯度较高，但步骤繁琐，耗时。利用沉淀法提取外泌体操作简单，但纯度和回收率低，杂蛋白较多，颗粒大小不均一，产生难以去除的聚合物等。PCV2是无囊膜病毒，在病毒感染细胞或细胞分泌病毒的过程中PCV2借助exosomes的结构，重新组装而排出体外，因此感染PCV2细胞分泌的exosomes的分离纯化和检测鉴定对于研究PCV2的传播机制显得尤为重要。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种PCV2感染PK-15细胞产生的外泌体分离和检测方法，具体是一种结合聚合物沉降法和蔗糖密度梯度离心法分泌感染PCV2的PK-15细胞的外泌体提取和检测方法。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为：本专利技术提供了一种外泌体的分离纯化方法，所述的外泌体是感染PCV2的PK-15细胞产生的，所述的分离纯化依次包括下列步骤：(1)将感染PCV2的PK-15细胞培养物经过纯化后获得细胞上清液低速离心去除细胞(包括死细胞)和细胞碎片，高速离心去除大膜泡；(2)再将细胞上清液与聚合物混合孵育，高速离心后得到外泌体粗提物；(3)将外泌体粗提物进行蔗糖密度梯度离心后得到外泌体。步骤(1)中，所述低速离心的离心力为2000-3000g，离心时间10-20分钟；所述高速离心的离心力为12000-18000g，离心时间为20-40分钟。进一步的，在本专利技术的一个优选实施例中，低速离心时离心力2500g，离心时间15分钟；高速离心为离心力15000g，离心时间为30分钟。步骤(2)中，所述混合孵育为将步骤(1)获得的细胞上清液与浓度为8-24％的聚乙二醇6000，按体积比为1：0.5-1:2，混合均匀，静置过夜；所述高速离心的离心力为12000-18000g，离心时间为30-90分钟。进一步的，在本专利技术的一个优选实施例中，聚乙二醇6000的浓度为16％，高速离心为离心力15000g，离心时间为60分钟。步骤(3)具体如下：将外泌体粗提物进行蔗糖密度梯度离心纯化，所用蔗糖浓度为25％-65％，离心力为100000g，离心时间90-150分钟；然后取外泌体样品层与PBS混合，再进行超速离心，离心力为100000g，离心时间为90-150分钟，弃上清，所得沉淀用PBS溶解即为高纯度的外泌体。进一步的，在本专利技术的一个优选实施例中，将外泌体粗提物进行蔗糖密度梯度离心纯化，所用蔗糖浓度为30％、45％和60％，离心为离心力100000g，离心时间120分钟，然后取外泌体品层与PBS混合，再进行超速离心，离心力100000g，离心时间120分钟，弃上清，所得沉淀用PBS溶解即为高纯度的外泌体。所获得的外泌体的直径为50-200nm。所述分离纯化获得的产物可以通过下列方法检测外泌体：透射电子显微镜确定外泌体形态、Westernblotting检测外泌体表面标志性蛋白和病毒结构蛋白。经透射电子显微镜观察发现，感染PCV2与未感染的PK-15细胞外泌体样品中发现直径大小约在100nm的盘状囊泡，样品中不含PCV2病毒粒子。外泌体标志性蛋白确定可以通过本领域常规的蛋白鉴定手段实现，使用Westernblotting检测外泌体的表面标志性蛋白是CD81和TSG101，以及PCV2ORF2蛋白。本专利技术具备以下有益效果：该方法提取的PCV2感染的PK-15细胞外泌体，有效去除细胞碎片及大膜泡，密度梯度离心后外泌体纯度高，粒径分布更集中，电镜形态背景更清晰，且不含PCV2病毒粒子，为研究外泌体在PCV2感染及传播中的研究奠定了坚实的理论和物质基础。附图说明图1透射电子显微镜下exosomes形态图；图2exosomes标志物TSG101和CD81蛋白检测的结果，以及PCV2ORF2检测结果。具体实施方式下面将结合具体实施例，对本专利技术的技术方案进行清楚、完整地描述，将有助于理解本专利技术，但是本专利技术的保护范围不限于下述的实施例，这些实施例仅用于说明本专利技术，其不以任何方式限制本专利技术的范围。本专利技术采用的材料、设备和方法均为本
的常规材料、设备和方法，其中聚乙二醇6000(PEG6000)、蔗糖及PBS缓冲液试剂采购于国药集团化学试剂有限公司；兔抗PCV2ORF2多克隆抗体、兔抗CD81多克隆抗体和山羊抗兔IgG-HRP购自北京博奥森生物技术有限公司，兔抗TSG101多克隆抗体购自Sigma公司，化学发光底物检测试剂盒购自上海碧云天生物公司。下述实施例中所用的材料、试剂，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1病毒感染及收集细胞上清PK-15细胞融合度达到80％时，将PCV2-SH(1×10-5.5TCID50·mL-1)按MOI＝1接种PK-15细胞，感染2h后，换为用无外泌体血清配置的2％的维持液，48h后收集细胞上清液；对照组PK-15细胞培养48h后收集细胞上清液。实施例2外泌体粗提物制备(1)配制浓度分别为8％、本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种猪圆环病毒2型感染PK-15细胞产生的外泌体分离纯化方法，其特征在于，所述的外泌体是感染PCV2的PK-15细胞产生的，所述的分离纯化方法依次包括下列步骤：/n（1）将细胞上清液低速离心去除细胞和细胞碎片，高速离心去除大膜泡；/n（2）再将细胞上清液与聚合物混合孵育，高速离心后得到外泌体粗提物；/n（3）将外泌体粗提物进行蔗糖密度梯度离心后得到外泌体。/n

【技术特征摘要】
1.一种猪圆环病毒2型感染PK-15细胞产生的外泌体分离纯化方法，其特征在于，所述的外泌体是感染PCV2的PK-15细胞产生的，所述的分离纯化方法依次包括下列步骤：
（1）将细胞上清液低速离心去除细胞和细胞碎片，高速离心去除大膜泡；
（2）再将细胞上清液与聚合物混合孵育，高速离心后得到外泌体粗提物；
（3）将外泌体粗提物进行蔗糖密度梯度离心后得到外泌体。


2.根据权利要求1所述的一种猪圆环病毒2型感染PK-15细胞产生的外泌体分离纯化方法，其特征在于，步骤（1）中，所述的细胞上清液是感染PCV2的PK-15细胞培养物经过纯化后获得。


3.根据权利要求1所述的一种猪圆环病毒2型感染PK-15细胞产生的外泌体分离纯化方法，其特征在于，步骤（1）中，所述低速离心的离心力为2000-3000g，离心时间10-20分钟；所述高速离心的离心力为12000-18000g，离心时间为20-40分钟。


4.根据权利要求1所述的一种猪圆环病毒2型感染PK-15细胞产生的外泌体分离纯化方法，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：段滇宁，沈华伟，邱龙新，陈洪博，张霖，黄敏，汪潜城，
申请(专利权)人：龙岩学院，
类型：发明
国别省市：福建;35