一种炎症检测试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种炎症检测试剂盒。本发明专利技术筛选获得特异性识别艰难梭菌GDH抗原单克隆抗体，将所述单克隆抗体标记量子点和其他抗体标记的硝酸纤维素膜制备获得抗体荧光量子点快速检测试纸，同时针对艰难梭菌毒素B的DNA序列进行分析，选取保守区设计RPA引物和探针，并制备成为相应的检测试纸条；将两个检测方法进行组合使用，能够进一步提高检测的准确性，从而及早诊断，利于患者尽快治疗，适于大规模推广使用。

【技术实现步骤摘要】
一种炎症检测试剂盒
本专利技术涉及生物检测领域,并且更具体地涉及一种炎症检测试剂盒。
技术介绍
艰难梭菌(Clostridiumdifficile，CD)，又称难辨梭状芽孢杆菌或难辨梭菌，是一种可形成孢子的、厌氧的革兰氏阳性杆菌，存在于环境、动物及人类的肠道中。1935年Holl等首次在健康新生儿大便中分离出该菌，并命名为难辨杆菌(Bacillusdifficilis)，以反映其培养的难度之大。1978年，Larson等和Bartlett等确认艰难梭菌是伪膜性肠炎的致病菌，且毒素的存在与致病性相关。目前，艰难梭菌已是发达国家医院感染性腹泻的主要病原菌。艰难梭菌侵入人体后，机体免疫系统与菌株毒力相互作用，其临床表现可有无症状携带、轻度到重度腹泻、结肠炎、伪膜性肠炎、肠梗阻、中毒性巨结肠和暴发性肠炎合并穿孔等，甚至危及生命。因艰难梭菌导致的感染或腹泻被称为艰难梭菌感染(Clostridiumdifficileinfection,CDI)或艰难梭菌相关性腹泻(Clostridiumdifficile-associateddiarrhea，CDAD)。艰难梭菌包括两类，产毒株和非产毒株。其产毒株可产生以下三种毒素：毒素A(ToxigenicClostridiumdifficileA，TcdA)、毒素B(ToxigenicClostridiumdifficileB，TcdB)及二元毒素(binarytoxin,CDT)。其中，毒素A与毒素B在艰难梭菌致病过程中影响最大，是主要致病因子。毒素A有肠毒性，以破坏肠道血管及黏膜为主，毒素B有细胞毒性，可进入肠上皮细胞，破坏细胞骨架肌动蛋白的形成从而引发临床症状。近些年大量临床研究显示，CDI患者可以只有毒素B的存在，当患者毒素A阴性而毒素B阳性时，其临床症状严重程度更高。目前公认的诊断CDI的“金标准”是细胞毒性试验和产毒培养(toxigenicculture，TC)。细胞毒性试验因操作复杂，价格昂贵且花费时间较长，不适合临床实验室日常开展。产毒培养是在先行培养得到艰难梭菌培养物后，通过聚合酶链反应(Polymerasechainreaction，PCR)扩增毒素基因以便进一步确认分型，优势在于具有较高的特异性和敏感性，但艰难梭菌培养困难，花费时间长且需要高精尖仪器辅助。谷氨酸脱氢酶(Glutamatedehydrogenase,GDH)是艰难梭菌表面表达的抗原性蛋白，具有较高的稳定性和灵敏性，但是对菌株是否存在产毒性无区分能力，因而需要与其他方法联合应用。GDH具有高敏感性，但存在假阳性及无法判断艰难梭菌中是否携帯有毒素基因的缺陷。而核酸检测可精确检测毒素基因分型，但大量样本进行基因检测花费巨大，周期长，需要高精尖仪器辅助，检测费用昂贵。因此，现有方法的临床敏感性不是十分理想。
技术实现思路
为了更好规避以上缺陷,为患者提供尽早、准确的诊断结果，提供了一种制备简单、成本低廉、使用方便、不需要高精尖仪器、更为准确、高效的检测试剂盒。所述试剂盒通过核酸-抗体双重检测方法对艰难梭菌进行检测，能更有效检测艰难梭菌及其基因分型(即是否携带毒素B基因),从而及早诊断，利于患者尽快治疗，并且避免过度治疗。本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供一种特异性结合艰难梭菌谷氨酸脱氢酶(GDH)的单克隆抗体G7-3，其包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区含有CDR1区、CDR2区和CDR3区，重链CDR1区、CDR2区和CDR3区的氨基酸序列分别如SEQIDNO:1、2和3所示；该轻链可变区含有CDR1区、CDR2区和CDR3区，其中轻链CDR1区、CDR2区和CDR3区的氨基酸序列分别如SEQIDNO:4、5和6所示。另一方面，本专利技术提供一种特异性结合艰难梭菌GDH的单克隆抗体G7-3，其包含重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区包含氨基酸序列SEQIDNO:7，轻链可变区包含氨基酸序列SEQIDNO:8。在一些实施方案中，本专利技术所述的抗艰难梭菌GDH的单克隆抗体包含两条重链和两条轻链，或由两条重链和两条轻链构成，其中各重链包含上述的重链恒定区序列、重链可变区序列或CDR序列，且各轻链包含上述的轻链恒定区序列、轻链可变区序列或CDR序列。本专利技术的抗体可以是全长抗体，所述全长抗体包含恒定区，所述全长抗体轻链恒定区进一步包含鼠源κ、λ链序列。所述全长抗体重链恒定区进一步包含鼠源IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgA或IgM序列。在一些实施方式中，本专利技术的抗艰难梭菌GDH的单克隆抗体是由上述的抗艰难梭菌抗体或抗体片段形成的Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fv片段、双抗体、线性抗体、单链抗体分子或多特异性抗体。本专利技术另外提供一种艰难梭菌荧光量子点快速检测试纸，其中将G7-3单克隆抗体标记量子点配制备而成。本专利技术提供另外一种用于快速检测艰难梭菌毒素B的试纸条RPA(LFDRPA)检测试剂盒，含有侧流层析试纸条，以及有一对引物和一条探针，其中所述上游引物序列如SEQIDNO:9所示，所述下游引物序列如SEQIDNO:10所示，所述探针的序列如SEQIDNO:11所示。具体的，上游引物(SEQIDNO:9)：CATTAATACATGATGGTCAATATTATTTTAATG下游引物(SEQIDNO:10)：Biotin-CTATATTCAACTGCTTGTCCGTAAATATTATC探针序列(SEQIDNO:11)：FAM-CTGGAGTACAAAACATAGATGATAATTATTTCTATATAGATGAGAAG在一些实施例中，本专利技术的探针在中间距5’端36bp的位置处采用dSpacer修饰，dSpacer分子两侧的距5’端35bp和37bp位置的胸腺嘧啶(dT)分别被荧光基团FAM和淬灭基团BHQ1取代，并且在探针的3’末端通过阻塞基团C3Spacer修饰。在一些实施例中，如上所述的核酸探针，所述荧光基团可替换为TAMARA，所述淬灭基团可替换为BHQ2；所述的脱碱基位点可替换为四氢呋喃；所述探针3’端的C3Spacer修饰可替换为磷酸化设计或连接biotin-TEG。所述试纸条带有检测线，检测线上固定有分子A；序列如SEQIDNO.10所述的引物，其末端带有特异性结合前述分子A的分子B。所述分子A是生物素配体，分子B是生物素。在本专利技术所述的试纸条RPA检测试剂盒中，优选的，所述试剂盒中还包括水解缓冲液，醋酸镁以及ddH2O。本专利技术提供的试纸条法，RPA探针中间位置的两个胸腺嘧啶核苷酸上分别标记一个荧光基团和一个荧光淬灭基团，两个基团之间设计一个脱碱基位点(dSpacer)，该位点可被具有3'-5'外切酶活性的核酸外切酶III识别、切割，游离荧光基团，从而发出荧光信号随后被荧光检测的仪器；同时留下可延伸3’-OH，DNA聚合酶以探针为“正向引物”继续延伸合成DNA，与反向引物(带亲和标记，例如生物素)一起扩增出一种带有双重标记(本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种特异性结合艰难梭菌GDH的单克隆抗体，其特征在于:所述单克隆抗体包括重链可变区，重链可变区包含SEQ ID NO:1所示的CDR1、SEQ ID NO:2所示的CDR2和SEQ ID NO:3所示的CDR3，以及轻链可变区，轻链可变区包含SEQ ID NO:4所示的CDR1、SEQ ID NO:5所示的CDR2和SEQ ID NO:6所示的CDR3。/n

【技术特征摘要】
1.一种特异性结合艰难梭菌GDH的单克隆抗体，其特征在于:所述单克隆抗体包括重链可变区，重链可变区包含SEQIDNO:1所示的CDR1、SEQIDNO:2所示的CDR2和SEQIDNO:3所示的CDR3，以及轻链可变区，轻链可变区包含SEQIDNO:4所示的CDR1、SEQIDNO:5所示的CDR2和SEQIDNO:6所示的CDR3。


2.一种特异性结合艰难梭菌GDH单克隆的抗体，其特征在于:所述单克隆抗体重链可变区序列如SEQIDNO:7所示,轻链可变区序列如SEQIDNO:8所示。


3.一种检测艰难梭菌的试剂盒，其特征在于所述试剂盒含有由权利要求1或2所述的单克隆抗体标记量子点制备而成的荧光量子点快速检测试纸条。


4.一种核酸-抗体双重检测艰难梭菌的试剂盒，所述试剂盒含有权利要求3所述的试剂盒和试纸条RPA检测试剂盒，所述试纸条RPA检测试剂盒包括一对引物和一条探针，所述的一对引物的序列如SEQIDNO:9和10所...

【专利技术属性】
技术研发人员：马红妙，张玲，
申请(专利权)人：北京保图生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11