一种重组Protein A蛋白及亲和层析介质的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种重组ProteinA蛋白及亲和层析介质的制备方法，所述的蛋白为SEQ ID No 1、SEQ ID No 2所定义的亲本免疫球蛋白‑结合蛋白的突变体；所述亲和层析介质的制备方法包括以下步骤：S1、合成重组ProteinA蛋白的基因，S2、利用所述S1中合成的基因分别构建表达载体，S3、培养并表达纯化得到序列对应的SEQ ID的重组Protein A溶液，S4、利用所述重组Protein A制备得到亲和层析介质。有益效果：本发明专利技术通过对氨基酸序列重新设计，大大提高Protein A在碱液中的化学稳定性，从而提供一种对抗体具有特异性结合作用的Protein A，其在碱性条件下具有良好的化学稳定性，重组Protein A亲和层析介质结合载量显著提高，可耐受0.5‑1.0M NaOH在位清洗，IgG结合载量60‑90mg/ml。

【技术实现步骤摘要】
一种重组ProteinA蛋白及亲和层析介质的制备方法
本专利技术涉及蛋白工程
，具体来说，涉及一种重组ProteinA蛋白及亲和层析介质的制备方法。
技术介绍
抗体类药物对疾病具有优异的疗效和安全性，已经在肿瘤类、心血管类，特别是自身免疫性疾病的治疗过程中逐步凸显重要作用，是目前生物类药物中增长率最高的一类药物。得益于高表达细胞系的构建、培养基的改良以及反应器规模不断扩大，单克隆抗体药物技术在过去几十年间得到迅猛发展。而单克隆抗体药物的制备过程中，抗体的纯化工艺尤为重要，其中，对抗体的捕获起着关键作用。而ProteinA亲和层析介质是目前抗体捕集和纯化过程中使用最为广泛以及技术最为成熟的一种方法，70％以上的抗体药物纯化工艺都运用该项技术。但是当前常用ProteinA亲和层析介质在抗体药物纯化过程中有以下缺陷，如：载量较低；抗体回收率较低，洗脱过程中，洗脱液的pH值较低，导致部分抗体发生变性，降低了抗体的回收率；配基脱落率高，并且存在成本高、寿命短和操作条件苛刻等问题。另外，为了降低成本，ProteinA亲和层析介质的重复使用是必需的。抗体洗脱后，ProteinA亲和层析介质需经严格验证的、标准的在位清洗(CIP)以除去介质上的杂蛋白、残留抗体及其聚合物、内毒素等杂质。而在位清洗的条件(0.5mol/L至1.0mol/L氢氧化纳溶液处理)对于ProteinA亲和层析介质而言是非常苛刻的，其直接结果就是ProteinA高级结构的破坏、介质吸附能力的下降和寿命的降低。现有技术中，ProteinA亲和层析介质在碱性条件下稳定性较为不理想，从而影响其应用。因此，对ProteinA亲和层析介质性能的提高己成为单抗药物制备的主要技术“瓶颈”和亟待突破的重点研究内容。
技术实现思路
针对相关技术中的问题，本专利技术提出一种配置方法，以克服现有相关技术所存在的上述技术问题。为此，本专利技术采用的具体技术方案如下：根据本专利技术的一个方面，提供了一种重组ProteinA蛋白，所述的重组ProteinA蛋白是由包含SEQIDNo1或SEQIDNo2指定的E或D结构域的突变体。进一步的，所述SEQIDNo1指定E结构域的突变体中2位，8位，42位的谷氨酰胺已经突变为选自酪氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸的氨基酸；所述SEQIDNo1指定E结构域的突变体中16位的天冬酰胺已经突变为选自苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、精氨酸、酪氨酸、亮氨酸、异亮氨酸的氨基酸；所述SEQIDNo1指定E结构域的突变体中22位，39位的甘氨酸已经突变为选自丙氨酸、丝氨酸的氨基酸。进一步的，所述SEQIDNo2指定D结构域的突变体中6位，9位，26位的天冬酰胺已经突变为选自苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、精氨酸、酪氨酸、亮氨酸、异亮氨酸的氨基酸；所述SEQIDNo2指定D结构域的突变体中12位的谷氨酰胺已经突变为选自酪氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸的氨基酸；所述SEQIDNo2指定D结构域的突变体中18位、56位的谷氨酸已经突变为选自甘氨酸、亮氨酸、精氨酸、天冬氨酸、苏氨酸、组氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸的氨基酸；所述SEQIDNo2指定D结构域的突变体中32位、49位的甘氨酸已经突变为选自丙氨酸、丝氨酸的氨基酸。进一步的，所述突变选自：Q2Y,Q2D,Q2F,Q2I,Q8Y,Q8D,Q8F,Q8I,Q42Y,Q42D,Q42F,Q42I,N16T,N16S,N16E,N16R,N16Y,N16L,N16I,G22A,G22S,G39A,G39S；且包含以下序列SEQIDNo3、SEQIDNo4、SEQIDNo5、SEQIDNo6、SEQIDNo7、SEQIDNo8、SEQIDNo9、SEQIDNo10、SEQIDNo11、SEQIDNo12、SEQIDNo13、SEQIDNo14、SEQIDNo15、SEQIDNo16、SEQIDNo17、SEQIDNo18、SEQIDNo19、SEQIDNo20、SEQIDNo21、SEQIDNo22。进一步的，所述突变选自：N6T,N6S,N6E,N6R,N6Y,N6L,N6I,N9T,N9S,N9E,N9R,N9Y,N9L,N9I,N26T,N26S,N26E,N26R,N26Y,N26L,N26I,Q12Y,Q12D,Q12F,Q12I,E18G,E18L,E18R,E18D,E18T,E18H,E18S,E18F,E56G,E56L,E56R,E56D,E56T,E56H,E56S,E56F,G32A,G32S,G49A,G49S；且包含以下序列SEQIDNo23、SEQIDNo24、SEQIDNo25、SEQIDNo26、SEQIDNo27、SEQIDNo28、SEQIDNo29、SEQIDNo30、SEQIDNo31、SEQIDNo32、SEQIDNo33、SEQIDNo34、SEQIDNo35、SEQIDNo36、SEQIDNo37、SEQIDNo38、SEQIDNo39、SEQIDNo40、SEQIDNo41、SEQIDNo42。进一步的，所述突变体包含4-8个重复单元，且包含以下序列SEQIDNo43、SEQIDNo44、SEQIDNo45、SEQIDNo46、SEQIDNo47、SEQIDNo48、SEQIDNo49、SEQIDNo50、SEQIDNo51、SEQIDNo52。进一步的，所述重组ProteinA蛋白C端包含一个半胱氨酸残基的偶联基团。根据本专利技术的另一个方面，提供了一种亲和层析介质的制备方法，该亲和层析介质的配基为以上所述的重组ProteinA蛋白，该亲和层析介质的制备方法包括以下步骤：S1、合成重组ProteinA蛋白的基因；S2、利用所述S1中合成的基因分别构建表达载体；S3、培养并表达纯化得到序列对应的SEQID的重组ProteinA溶液；S4、利用所述重组ProteinA制备得到亲和层析介质。进一步的，所述S2中的表达载体为PET23a。进一步的，所述S3中培养并表达纯化得到对应序列的重组ProteinA溶液具体包括以下步骤：S31、利用单个重组质粒转化到大肠杆菌，并通过LB液体培养基进行发酵培养并进行诱导表达；S32、发酵后，收集菌体并采用热裂解的方式破坏细胞壁将表达产物释放出来并离心分离；S33、将分离液体经过IgG亲和介质进行纯化。本专利技术的有益效果为：1)、本专利技术通过对氨基酸序列重新设计，大大提高ProteinA在碱液中的化学稳定性，从而提供一种对抗体具有特异性结合作用的ProteinA，其在碱性条件下具有良好的化学稳定性，重组ProteinA亲和层析介质结合载量显著提高，可耐受0.5-1.0MNaOH在位清洗，IgG结合载量60-90mg/ml。2)、本专利技术还提供了一种利用该突变结构域的ProteinA为配基的亲和层析介质制备方法，与以结构域Z及其寡聚体为配基的亲和层析介质相比，本专利技术制本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组Protein A蛋白，其特征在于，所述的重组Protein A蛋白是由包含SEQ IDNo 1或SEQ ID No 2指定的E或D结构域的突变体。/n

【技术特征摘要】
1.一种重组ProteinA蛋白，其特征在于，所述的重组ProteinA蛋白是由包含SEQIDNo1或SEQIDNo2指定的E或D结构域的突变体。


2.根据权利要求1所述的一种重组ProteinA蛋白，其特征在于，所述SEQIDNo1指定E结构域的突变体中2位，8位，42位的谷氨酰胺已经突变为选自酪氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸的氨基酸；
所述SEQIDNo1指定E结构域的突变体中16位的天冬酰胺已经突变为选自苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、精氨酸、酪氨酸、亮氨酸、异亮氨酸的氨基酸；
所述SEQIDNo1指定E结构域的突变体中22位，39位的甘氨酸已经突变为选自丙氨酸、丝氨酸的氨基酸。


3.根据权利要求1所述的一种重组ProteinA蛋白，其特征在于，所述SEQIDNo2指定D结构域的突变体中6位，9位，26位的天冬酰胺已经突变为选自苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、精氨酸、酪氨酸、亮氨酸、异亮氨酸的氨基酸；
所述SEQIDNo2指定D结构域的突变体中12位的谷氨酰胺已经突变为选自酪氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸的氨基酸；
所述SEQIDNo2指定D结构域的突变体中18位、56位的谷氨酸已经突变为选自甘氨酸、亮氨酸、精氨酸、天冬氨酸、苏氨酸、组氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸的氨基酸；
所述SEQIDNo2指定D结构域的突变体中32位、49位的甘氨酸已经突变为选自丙氨酸、丝氨酸的氨基酸。


4.根据权利要求2所述的一种重组ProteinA蛋白，其特征在于，所述突变选自：
Q2Y,Q2D,Q2F,Q2I,Q8Y,Q8D,Q8F,Q8I,Q42Y,Q42D,Q42F,Q42I,N16T,N16S,N16E,N16R,N16Y,N16L,N16I,G22A,G22S,G39A,G39S；且包含以下序列SEQIDNo3、SEQIDNo4、SEQIDNo5、SEQIDNo6、SEQIDNo7、SEQIDNo8、SEQIDNo9、SEQIDNo10、SEQIDNo11、SEQIDNo12、SEQIDNo13、SEQIDNo14、SEQIDNo15、SEQIDNo16、SEQIDNo17、SEQIDNo18、SEQIDNo19、SEQIDNo20、SEQIDNo21、SEQIDNo22。


5.根据权利要求3所述的一种重组ProteinA蛋白，其特征在于，所述突变选自：
N6T,N6S,N6E,N6R,N6Y,N6L,N6I,N9T,N9S,N9E,N9R,N9...

【专利技术属性】
技术研发人员：张洪，
申请(专利权)人：平湖优谱生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33