一种高效连续化纯化β-烟酰胺单核苷酸的方法技术

本发明专利技术公开一种高效连续化纯化β‑烟酰胺单核苷酸的方法，将β‑烟酰胺单核苷酸粗品配置成β‑烟酰胺单核苷酸母液，将β‑烟酰胺单核苷酸母液上样至含有固相吸附材料的色谱分离柱中，洗脱液洗脱，收集洗脱液，即得纯化后的β‑烟酰胺单核苷酸。本发明专利技术所提供的高效连续化β‑烟酰胺单核苷酸纯化方法工艺过程简单、分离效率高、可连续生产、工艺废液低。所得β‑烟酰胺单核苷酸产品纯度在99.5％以上，回收率在95％以上。

【技术实现步骤摘要】
一种高效连续化纯化β-烟酰胺单核苷酸的方法
本专利技术涉及烟酰胺单核苷酸的分离纯化
，具体涉及一种高效连续化纯化β-烟酰胺单核苷酸的方法。
技术介绍
β-烟酰胺单核苷酸(NMN)是人体内固有的物质，也富含在一些水果和蔬菜中，包括西兰花、卷心菜、黄瓜、毛豆、鳄梨等。β-烟酰胺单核苷酸是人体中主要能量物质长寿蛋白辅因子NAD+的前体。研究表明，随着人类年龄的增大，身体中NAD+持续减少，导致人体中细胞功能下降，从而导致人体衰老，新陈代谢失调等。2013年，大卫·辛克莱教授通过小白鼠实验发现NMN具有抗衰老功效。2016年，今井真一郎团队联合日本庆应大学开展世界首例关于NMN的临床实验。目前NMN在抗衰老领域取得广泛的关注。同时NMN在医药治疗领域和化工合成方面具有广泛的应用前景。市场及临床使用对NMN所需求的纯度较高。目前研究者主要在两个方面进行相关研究来提高NMN的纯度。1、新的制备方法研究，开发新的制备方法或者对原有工艺进行改进以降低所得产物中副产物。但是该方法所需要的研发投入过大且周期过长，同时针对制备过程中副反应很难避免。目前研究者将目光转向对制备产物进行分离纯化的工艺研究。2、制备产物分离纯化工艺的研究。NMN常规纯化方法是使用离子交换树脂或者常规螯合树脂进行分离纯化和高效液相色谱法。专利CN111377983A一种β-烟酰胺单核苷酸的制备方法，将β-烟酰胺单核苷酸反应产物依次经过蛋白膜过滤、高压脱盐膜浓缩、阴离子交换树脂分离纯化、浓缩结晶后得到β-烟酰胺单核苷酸纯品。专利PCT/CN2016/092455一种烟酰胺单核苷酸的纯化方法，将生物催化法制备的烟酰胺单核苷酸粗产物经过阴离子交换柱、纳滤、螯合树脂吸附与解吸附，最后得到相对较纯的烟酰胺单核苷酸成品。专利PCT/CN2015/096215一种β-烟酰胺单核苷酸的纯化方法使用反相高效液相色谱制备柱，固定相为十八烷基硅烷键合硅胶，流动相A为pH＝3-7盐酸溶液，流动相B相为乙醇，进行梯度洗脱纯化。获得纯化的β-烟酰胺单核苷酸。专利CN112159445Aβ-烟酰胺单核苷酸的纯化方法和制备方法使用硅胶柱对β-烟酰胺单核苷酸粗产物进行层析分离，采用醇做流动相进行梯度洗脱。得到纯度较高的β-烟酰胺单核苷酸。离子交换法的局限性在于制备产物中具有多种类似物且带电性和结构极为相似。使用常规离子交换树脂无法实现很好的分离纯化，产品纯度达不到要求。螯合树脂法的局限性在于螯合速率(0.01-0.03BV/min)较慢导致生产率低下，无法规模生产。目前常规高效液相色谱法是使用硅胶分离材料作为固定相、盐酸和醇作为流动相配合检测器进行分离纯化。其局限性在于常规硅胶分离材料不耐酸碱导致固相材料损耗较高。流动相为酸和醇的混合液，废液成分比较复杂。配合检测器收集导致设备投入较高，自动化连续生产相对较难实现。
技术实现思路
专利技术目的：本专利技术所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种高效连续化纯化β-烟酰胺单核苷酸的方法。专利技术思路：NMN相对于烟酰胺核糖苷(NR)结构的差异是NMN具有HPO4-结构，其他结构完全一致，同时NMN相对于其他盐类杂质具有NR环状结构，分子大小上具有很大的差异性。所以同时在这几类物质实现NMN的分离纯化，所以需要开发一种特定的固相分离材料和分离纯化工艺。本专利技术采用新型介孔固相分离材料且末端进行季胺基团改性，末端季胺基团结构离子交换作用配合介孔结构可以使NMN快速进入孔道。不同梯度浓度的氯化钠溶液实现对固相材料不同的溶胀，导致目标物和杂质在不同的梯度浓度分别洗脱。从而实现NMN的分离纯化。为了解决上述技术问题，本专利技术公开了一种高效连续化纯化β-烟酰胺单核苷酸的方法，将β-烟酰胺单核苷酸粗品配置成β-烟酰胺单核苷酸母液，将β-烟酰胺单核苷酸母液上样至含有固相吸附材料的色谱分离柱中，洗脱液洗脱，收集洗脱液，即得纯化后的β-烟酰胺单核苷酸；用超纯水平衡色谱柱后，循环上样。其中，所述固相吸附材料是以苯乙烯-二乙烯苯共聚物为骨架结构，端基为季铵基团修饰；优选地，所述固相吸附材料的全交换量为4mmol/g以上；进一步优选地，所述固相吸附材料的全交换量为4-8mmol/g；更进一步优选地，所述固相吸附材料的全交换量为6mmol/g。其中，所述固相吸附材料的粒径为5-100μm，优选为25-70μm。其中，所述固相吸附材料的比表面积为400-1000m2/g，优选为700-900m2/g，进一步优选为800m2/g。其中，固相吸附材料的孔道结构为介孔。其中，孔径为20-500A，优选为100-200A。其中，孔容为0.6-1.2cm3/g，优选为0.8cm3/g。本专利技术采用低粒径介孔结构固相分离材料，且粒径均一，可使得吸附速率和解吸附速率更快，更利于后期工业化；且正是由于在该孔道大小的情况下，才能有效实现样品的吸附与分离，若孔道太大则实现不了样品吸附与分离。其中，所述色谱分离柱制备方法为将固相吸附材料分散于超纯水中，超声分散(对超声频率没有具体的要求，仅需分散均匀即可)，采用DAC-50动态压缩柱(购买自江苏汉邦科技有限公司)。装柱采用湿法装柱，将200mL固定相置于柱筒，装柱压力20-40bar，优选25bar，装柱时间5-10min，优选5min，超纯水冲洗色谱分离柱(1-3BV)。其中，所述β-烟酰胺单核苷酸粗品中β-烟酰胺单核苷酸的纯度为60％以下，其他为无机盐、具有NR环状的副产物等杂质。其中，所述β-烟酰胺单核苷酸母液为将β-烟酰胺单核苷酸用超纯水配置而成。其中，所述β-烟酰胺单核苷酸母液中β-烟酰胺单核苷酸粗品的浓度为0.1-20g/L。其中，所述β-烟酰胺单核苷酸母液的上样速率为0.2-1BV/min，优选为0.2BV/min。其中，所述β-烟酰胺单核苷酸母液的上样量为4-10BV。其中，所述洗脱为梯度洗脱，包括三梯度，第一梯度为水洗脱5-10BV、第二梯度为0.04-0.06M盐溶液洗脱5-10BV、第三梯度为0.8-1.2M盐溶液洗脱5-10BV；优选地，第一梯度为水洗脱6BV、第二梯度为0.04-0.06M盐溶液洗脱6BV、第三梯度为1M盐溶液洗脱5BV。其中，所述盐溶液包括但不限于氯化钠水溶液和氯化钾水溶液；优选地，所述盐溶液为氯化钠水溶液。其中，本专利技术采用氯化钠溶液进行洗脱可以保证其与样品没有化学反应，同时，氯化钠可以与吸附在固定相材料上的样品、杂质形成离子交换作用；并且苯乙烯类骨架高分子固相介孔材料在不同浓度氯化钠溶液形成不同程度的溶胀。最终可以使得样品、杂质形成梯度洗脱分离。其中，所述洗脱的速率为0.2-1BV/min；优选地，所述洗脱的速率为0.2BV/min。其中，所述收集洗脱液为收集第二梯度的洗脱液。本专利技术中，所述纯度，若无特殊说明，均为质量百分比。有益效果：与现有技术相比，本专利技术具有如下优势：(1)本专利技术所提供的固相分离材本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高效连续化纯化β-烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于，将β-烟酰胺单核苷酸粗品配置成β-烟酰胺单核苷酸母液，将β-烟酰胺单核苷酸母液上样至含有固相吸附材料的色谱分离柱中，洗脱液洗脱，收集洗脱液，即得纯化后的β-烟酰胺单核苷酸。/n

【技术特征摘要】
1.一种高效连续化纯化β-烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于，将β-烟酰胺单核苷酸粗品配置成β-烟酰胺单核苷酸母液，将β-烟酰胺单核苷酸母液上样至含有固相吸附材料的色谱分离柱中，洗脱液洗脱，收集洗脱液，即得纯化后的β-烟酰胺单核苷酸。


2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述固相吸附材料是以苯乙烯-二乙烯苯共聚物为骨架结构，端基为季铵基团修饰。


3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述固相吸附材料的粒径为5-100μm，比表面积为400-1000m2/g。


4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述固相吸附材料的孔道结构为介孔，孔径为20-500A，孔容为0.6-1.2cm3/g。


5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述β-烟酰胺单核苷酸粗品中β-烟...

【专利技术属性】
技术研发人员：江伟，任连兵，魏士明，李俊，孙平，梁东诚，张全兴，
申请(专利权)人：南京大学，南京全凯生物基材料研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32