检测莫氏立克次体的引物组合物及其应用制造技术

本发明专利技术公开了检测或辅助检测莫氏立克次体的引物组合物,所述引物组合物是特异扩增含有核苷酸序列是SEQ ID No.7的片段在内的莫氏立克次体基因组DNA片段的引物对。所述引物组合物由名称为F3的单链DNA、名称为B3的单链DNA、名称为FIP的单链DNA、名称为BIP的单链DNA、名称为LoopF的单链DNA和名称为LoopB的单链DNA组成。本发明专利技术的实验结果证明，使用所述引物组合物用环介导等温扩增检测莫氏立克次体，快速且高效，扩增反应在60分钟内即可完成，只需在恒定温度就能完成大量扩增反应，无需专业PCR设备；检测结果特异性好、灵敏度高；鉴定方法简单方便，适用于临床标本的快速检测。

【技术实现步骤摘要】
检测莫氏立克次体的引物组合物及其应用
本专利技术属于生物
，尤其涉及一组莫氏立克次体的引物组合物及其应用。
技术介绍
斑疹伤寒(Scrubtyphus)是由斑疹伤寒立克次体所致的一类自然疫源性人兽共患病，在传染病管理法中属于乙类传染病管理。莫氏立克次体(Rickettsiatyphi)是斑疹伤寒立克次体的一种，其感染引起地方性斑疹伤寒呈世界性分布，鼠类是贮存宿主，蚤是传播媒介，呈鼠―蚤―人传播循环。人感染莫氏立克次体后，经两周左右的潜伏期后发病，主要表现为发热、头痛、皮疹和淋巴结肿大，伴有神经系统、心动过缓、中耳炎、肺炎等临床症状。目前没有标准化的莫氏立克次体临床诊断方法。传统的外斐实验特异性和敏感性差，只能作为辅助诊断。实验室诊断方法主要有血清学方法和分子生物学方法。血清学诊断以间接免疫荧光为主，然而此方法在发病后1-2周才能检测到斑疹伤感立克次体抗体，时效性差，且与其他立克次体存在交叉反应。分子生物学诊断方法准确，现有的方法基于普通PCR或实时荧光定量PCR检测斑疹伤寒立克次体，但需要使用专业的仪器，反应时间也较长，且检测的敏感性有待提高，并不能适应临床的、“简便、快速、灵敏”的要求。环介导等温扩增(Loop-mediatedisothermalamplification，LAMP)能在等温条件下，短时间内完成痕量核酸大量扩增，直接肉眼观察白色沉淀或者绿色荧光即可判断靶基因是否存在，是一种适合现场的、“简便、快速、灵敏、精确”的基因扩增检测方法。LAMP技术中，引物是决定检测结果灵敏度和特异性的关键因素。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是如何以高灵敏度、高特异性的方法快速、简便的实现莫氏立克次体的现场检测。为解决上述技术问题，本专利技术提供了如下技术方案：提供检测或辅助检测莫氏立克次体的引物组合物，所述引物组合物是特异扩增含有核苷酸序列是SEQIDNo.7的片段在内的莫氏立克次体基因组DNA片段的引物对。进一步地，所述引物组合物是特异扩增核苷酸序列是SEQIDNo.7的片段的引物对。进一步地，所述特异扩增为环介导等温扩增。所述引物组合物由名称为F3的单链DNA、名称为B3的单链DNA、名称为FIP的单链DNA、名称为BIP的单链DNA、名称为LoopF的单链DNA和名称为LoopB的单链DNA组成；所述F3为核苷酸序列是序列表中SEQIDNo.1的单链DNA或其衍生物；所述B3为核苷酸序列是序列表中SEQIDNo.2的单链DNA或其衍生物；所述FIP为核苷酸序列是序列表中SEQIDNo.3的单链DNA或其衍生物；所述BIP为核苷酸序列是序列表中SEQIDNo.4的单链DNA或其衍生物；所述LoopF为核苷酸序列是序列表中SEQIDNo.5的单链DNA或其衍生物；所述LoopB为核苷酸序列是序列表中SEQIDNo.6的单链DNA或其衍生物。所述衍生物为如下1)-3)中任一种：1)、将各引物的核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与各引物的核苷酸序列具有相同功能的DNA分子；2)、与各引物的核苷酸序列具有大于等于85％同源性且与各引物的核苷酸序列具有相同功能的DNA分子；3)、各引物核苷酸序列的反向互补序列。进一步地，所述引物组合物中，所述F3、B3、FIP、BIP、LoopF和LoopB的摩尔比为1:1:8:8:4:4。在本专利技术的实施例中，引物F3的浓度为5pmol/L、引物B3的浓度为5pmol/L、引物FIP的浓度为40pmol/L、引物BIP的浓度为40pmol/L、引物LoopF的浓度为20pmol/L和引物LoopB的浓度为20pmol/L。本专利技术提供检测或辅助检测莫氏立克次体的试剂或试剂盒，所述试剂或试剂盒含有权利要求所述的引物组合物。进一步地，所述试剂或试剂盒为环介导等温扩增试剂或试剂盒。所述试剂或试剂盒还包括进行环介导等温扩增需要的其它试剂(如BstDNA聚合酶)。如上所述系统的制备方法，包括将所述F3、所述B3、所述FIP、所述BIP、所述LoopF和所述LoopB分别单独包装的步骤。上述环介导等温扩增的引物组合物在如下A1)-A6)至少一种中的应用也是本专利技术保护的范围：A1)检测或辅助检测莫氏立克次体；A2)检测或辅助检测待测样本是否感染莫氏立克次体；A3)检测或辅助检测待测菌体为莫氏立克次体；A4)制备检测或辅助检测莫氏立克次体的产品；A5)制备检测或辅助检测待测样本是否感染莫氏立克次体的产品；A6)制备检测或辅助检测待测菌体为莫氏立克次体的产品。所述产品可以是试剂、试剂盒或系统。本专利技术提供了一种检测或辅助检测待测菌体是否为莫氏立克次体的方法，包括如下步骤：用上述环介导等温扩增的成套引物对待测立克次体进行环介导等温扩增，得到环介导等温扩增反应产物；根据所述环介导等温扩增反应产物判断或辅助判断待测菌体是否为莫氏立克次体。上述根据环介导等温扩增反应产物判断或辅助判断待测菌体是否为莫氏立克次体方法如下1)-3)中任一种：1)用实时浊度仪检测所述环介导等温扩增反应产物，若所述环介导等温扩增反应产物具有典型的扩增曲线，则待测菌体为或候选为莫氏立克次体；2)检测所述环介导等温扩增反应产物是否浑浊，若所述环介导等温扩增反应产物浑浊(与反应前的体系相比)，则待测立克次体为或候选为莫氏立克次体；3)在环介导等温扩增的体系中加入荧光染料，若所述环介导等温扩增反应产物荧光颜色与反应前有变化，则待测菌体为或候选为莫氏立克次体。或，本专利技术还提供了一种检测或辅助检测待测样本是否感染莫氏立克次体的方法。本专利技术提供的方法，包括如下步骤：用上述环介导等温扩增的成套引物对待测立克次体进行环介导等温扩增，得到环介导等温扩增反应产物；根据所述环介导等温扩增反应产物判断或辅助判断待测样本是否感染莫氏立克次体。上述根据环介导等温扩增反应产物判断或辅助判断待测样本是否感染莫氏立克次体的方法如下：1)用实时浊度仪检测所述环介导等温扩增反应产物，若所述环介导等温扩增反应产物具有典型的扩增曲线，则待测样本感染或候选感染莫氏立克次体；2)检测所述环介导等温扩增反应产物是否浑浊，若所述环介导等温扩增反应产物浑浊(与反应前的体系相比)，则待测样本感染或候选感染莫氏立克次体；3)在环介导等温扩增的体系中加入荧光染料，若所述环介导等温扩增反应产物荧光颜色与反应前有变化，则待测样本感染或候选感染莫氏立克次体。上述方法中的环介导等温扩增反应的条件为：60-65℃反应30-90min，再80℃孵育5min终止反应。本专利技术的实验证明，专利技术人设计合成了环介导等温扩增的引物组合物，采用环介导等温扩增法对莫氏立克次体进行特异性检测，优点如下：(1)只需在恒定温度就能完成大量扩增反应，无需专业PCR设备；(2)特异性高本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.检测或辅助检测莫氏立克次体的引物组合物，其特征在于：所述引物组合物是特异扩增含有核苷酸序列是SEQ ID No.7的片段在内的莫氏立克次体基因组DNA片段的引物对。/n

【技术特征摘要】
1.检测或辅助检测莫氏立克次体的引物组合物，其特征在于：所述引物组合物是特异扩增含有核苷酸序列是SEQIDNo.7的片段在内的莫氏立克次体基因组DNA片段的引物对。


2.如权利要求1所述的引物组合物，其特征在于，所述引物组合物是特异扩增核苷酸序列是SEQIDNo.7的片段的引物对。


3.如权利要求1或2所述的引物组合物，其特征在于，所述特异扩增为环介导等温扩增。


4.如权利要求1、2或3所述的引物组合物，其特征在于，所述引物组合物由名称为F3的单链DNA、名称为B3的单链DNA、名称为FIP的单链DNA、名称为BIP的单链DNA、名称为LoopF的单链DNA和名称为LoopB的单链DNA组成；
所述F3为核苷酸序列是序列表中SEQIDNo.1的单链DNA或其衍生物；
所述B3为核苷酸序列是序列表中SEQIDNo.2的单链DNA或其衍生物；
所述FIP为核苷酸序列是序列表中SEQIDNo.3的单链DNA或其衍生物；
所述BIP为核苷酸序列是序列表中SEQIDNo.4的单链DNA或其衍生物；
所述LoopF为核苷酸序列是序列表中SEQIDNo.5的单链DNA或其衍生物；
所述LoopB为核苷酸序列是序列表中SEQIDNo.6的单链DNA或其衍生物。


5.如权利要求1-4中任一所述的引物组合物，其特征在于：所述引物组合物中，所述F3、B3、FIP、BIP、LoopF和LoopB的...

【专利技术属性】
技术研发人员：焦俊，熊小路，赵月峨，周冬生，欧阳譞，于永慧，吴妮尔，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事科学院军事医学研究院，
类型：发明
国别省市：北京;11