一种提高实时荧光定量PCR特异性的方法技术

本发明专利技术公开了一种基于氧化石墨烯量子点提高实时荧光定量PCR特异性的方法：它是使用氧化石墨烯量子点对实时荧光定量PCR引物预处理后，再将引物应用于实时荧光定量PCR。本发明专利技术的优点在于：利用氧化石墨烯量子点优化实时荧光定量PCR的综合优化效果更佳，可以有效提高实时荧光定量PCR扩增产物的产量和特异性。且优化所需的氧化石墨烯量子点用量低。此外，氧化石墨烯量子点的制备步骤简单，贮存方便。

【技术实现步骤摘要】
一种提高实时荧光定量PCR特异性的方法
本专利技术属于生物分子检测领域，具体涉及一种基于氧化石墨烯量子点提高实时荧光定量PCR特异性的方法。
技术介绍
氧化石墨烯量子点(GOQDs)是一种零维碳纳米材料，表面含有丰富的含氧官能团；GOQDs能够使用光芬顿法(Photo-Fentonreaction)制备得到。由于GOQDs具有良好的结构和物理化学性质，GOQDs广泛应用于生物医药各领域。例如：研究发现光芬顿法制备的GOQDs可以与铜离子形成复合物从而对DNA链进行切割，为GOQDs在肿瘤治疗等生物学和医学研究中的进一步应用提供了可能(Photo-Fentonreactionofgrapheneoxide：anewstrategytopreparegraphenequantumdotsforDNAcleavage，ACSNano，2012，6，6592-6599.)。光芬顿法制备的GOQDs实现了对氧化石墨烯的降解，在环境保护等方面应用范围较广(InsightintotheMechanismofGrapheneOxideDegradationviathePhoto-FentonReaction，JournalofPhysicalChemistryCNanomaterials&Interfaces，2014，118，10519.)等。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)是利用荧光信号的变化，实时检测PCR扩增反应中每个循环扩增产物量的变化，通过对循环阈值和标准曲线的分析，进而对标本中起始模板拷贝数进行定量分析。当模板含量过低时，qRT-PCR易出现假阳性结果及非特异性扩增，导致定量不准确。近年来，有研究旨在提升qRT-PCR的性能，以获得更精确的结果。例如：有研究报道，利用C60可提高qRT-PCR的性能(C60affectsDNAreplicationinvitrobydecreasingthemeltingtemperatureofDNAtemplates，2009,47，1457-1465)；但C60的制作步骤极复杂，成品C60价格又极高，难以在qRT-PCR应用中推广。又有专利报道将石墨烯量子点(GQDs)应用于传统PCR可提高传统PCR的特异性，改善传统PCR的综合优化效果(专利公开号：CN103773757A)；GQDs能提高PCR特异性是由于其表面全为sp2共轭区域，能够能够通过π-π共轭吸附单链DNA，减少PCR过程中非特异性扩增的发生；但相较于传统PCR，qRT-PCR要求更为严格，因为qRT-PCR中使用的荧光染料分子(或基团)本身和sp2区域间能形成π-π共轭从而淬灭荧光染料分子的荧光，可导致qRT-PCR检测不到荧光信号，因而难以直接将GQDs应用于qRT-PCR。目前，尚未见报道将氧化石墨烯量子点应用于qRT-PCR的相关技术。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种基于氧化石墨烯提高实时荧光PCR灵敏度和特异性的方法。本专利技术的技术方案包括：一种荧光定量PCR引物预处理方法，它是将氧化石墨烯量子点与引物混合，在15～35℃温度下，孵育30±5min。如前述的预处理方法，所述温度为35℃，和/或，所述孵育时间为30min。如前述的预处理方法，氧化石墨烯量子点与引物混合前，氧化石墨烯量子点超声处理30min。如前述的预处理方法，氧化石墨烯量子点与正向引物或反向引物的用量比是1.5～11μg∶0.01μmol，优选地，为2.2～11μg∶0.01μmol；进一步优选地，为5.3～11μg∶0.01μmol；更进一步优选地，为5.3μg∶0.01μmol。一种优化荧光定量PCR的方法，它是使用前述预处理方法，使用氧化石墨烯量子点对引物进行处理后，配制成荧光定量PCR反应体系，进行荧光定量PCR。如前述的方法，所述实时荧光定量PCR为TaqMan探针法。如前述的预处理方法，以及前述的提高荧光定量PCR灵敏度和特异性的方法，所述氧化石墨烯量子点的制备方法包括如下步骤：1)将1重量份的石墨置于40～50体积份的浓H2SO4中，加入0.8～1.2重量份的NaNO3，得体系A；2)将MnO3+分次加入体系A中，单次加入量按MnO3+计不超过0.15重量份，累计加入3.5-4.0重量份MnO3+，反应得到嵌锰石墨；3)取嵌锰石墨，加水配成悬液，每10g嵌锰石墨加入30％的双氧水500～1200mL和1～2g零价铁，持续沸腾6min；4)将3)中产物在去离子水中透析7天，得到氧化石墨烯量子点水溶液；当体积份为mL时，重量份为g；优选地，步骤1)中浓H2SO4为44～48体积份，和/或，NaNO3为0.9～1.1重量份。进一步的，氧化石墨烯量子点的制备方法的步骤2)中MnO3+溶液的制备方法为：将5～10重量份的KMnO4加入140～150体积份的浓H2SO4，并加入1重量份NaNO3形成MnO3+；优选地，将5～6重量份的KMnO4加入144～148体积份的浓H2SO4，并加入1重量份NaNO3形成MnO3+。氧化石墨烯量子点在提高实时荧光定量PCR特异性中的用途。一种荧光定量PCR试剂盒，所述试剂盒中含有提高荧光定量PCR特异性的成分；所述提高荧光定量PCR特异性的成分是氧化石墨烯量子点。与GQDs类似，GOQDs也存在sp2区域，能够通过π-π共轭吸附部分单链DNA，抑制非特异性扩增发生。按常理推断，GOQDs也会因为sp2区域的存在，通过π-π共轭淬灭荧光。但是，GOQDs表面富含大量含氧官能团，存在大量的sp3区域，sp3区域可减弱荧光基团与氧化石墨烯量子点间的π-π共轭，使荧光基团远离氧化石墨烯量子点表面，减少荧光淬灭。本专利技术的方法，将GOQDs应用于荧光定量PCR，能增强PCR的特异性，并保证其荧光信号强度维持较高水平，适用于复杂样本或高度近似样本的检测，应用价值较高。本专利技术优选的一种实施方式，使用改良芬顿法制备GOQDs，相比光芬顿法相比，理论上可提高GOQDs表面的羟基含氧官能团的比例，羧基比例则相对减少。实验证明，本专利技术的GOQDs制备方法得到的GOQDs，相比光芬顿法得到的GOQDs，更有利于在增强荧光定量PCR特异性的同时，减少荧光信号淬灭。另外，因为sp2区域对单链DNA有吸附作用，当DNA模板量较低时，目标DNA以及前几次qPCR扩增循环产生特异性扩增产物被大比例吸附，最终可能导致实际参与qPCR的模板量过少；而本领域公知的，模板量过少会导致qPCR检测准确性变差。但意想不到的是，在初始模板拷贝数104-1010copies/μl范围内，本专利技术的Ct值与初始模版拷贝数的对数呈线性关系，表明本专利技术在低模板浓度(104copies/μl)下的检测依然很准确。显然，根据本专利技术的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本专利技术上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种荧光定量PCR引物预处理方法，其特征在于：它是将氧化石墨烯量子点与引物混合，在15～35℃温度下，孵育30±5min。/n

【技术特征摘要】
1.一种荧光定量PCR引物预处理方法，其特征在于：它是将氧化石墨烯量子点与引物混合，在15～35℃温度下，孵育30±5min。


2.如权利要求1所述的预处理方法，其特征在于：所述温度为35℃，和/或，所述孵育时间为30min。


3.如权利要求1所述的预处理方法，其特征在于：氧化石墨烯量子点与引物混合前，氧化石墨烯量子点超声处理30min。


4.如权利要求1～3任一所述的预处理方法，其特征在于：氧化石墨烯量子点与正向引物或反向引物的用量比是1.5～11μg∶0.01μmol，优选地，为2.2～11μg∶0.01μmol；进一步优选地，为5.3～11μg∶0.01μmol；更进一步优选地，为5.3μg∶0.01μmol。


5.一种优化荧光定量PCR的方法，其特征在于：它是使用权利要求1～4任一所述预处理方法，使用氧化石墨烯量子点对引物进行处理后，配制成荧光定量PCR反应体系，进行荧光定量PCR。


6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：所述实时荧光定量PCR为TaqMan探针法。


7.如权利要求1～6任一所述的方法，其特征在于：所述氧化石墨烯量子点的制备方法包括如下步骤：
1)将1重量份的石墨置于40～50体积份的浓H2S...

【专利技术属性】
技术研发人员：何洋，杨中柱，宋瑱，胡晨妍，
申请(专利权)人：成都中医药大学，
类型：发明
国别省市：四川;51