一株木贼镰刀菌L1293及其应用制造技术

本发明专利技术属于微生物发酵制备玉米赤霉烯酮技术领域。本发明专利技术公开了一株木贼镰刀菌(Fusarium equiseti)L1293，其保藏编号为CGMCC NO.19032该菌株已于2019年12月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.19032，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。本发明专利技术的菌株具有高效玉米赤霉烯酮(ZEN)合成能力。

【技术实现步骤摘要】
一株木贼镰刀菌L1293及其应用
本专利技术属于微生物发酵制备玉米赤霉烯酮

技术介绍
真菌毒素(mycotoxin)是产毒真菌分泌产生的，能引起人畜各种损害的次级代谢产物。玉米赤霉烯酮(ZEN)，又称F-2毒素，具有生殖、免疫、肝脏、细胞等毒性以及致癌性，严重威胁动物及人类的健康安全。随人们对食品的健康和安全高度重视，对真菌毒素的检测越来越严格，检测范围越来越广泛。目前国内检测所需玉米赤霉烯酮(ZEN)标准物质绝大多数依赖于进口，价格昂贵。为了保证检测分析所需ZEN标准物质的供应，减少进口依赖。筛选获得ZEN高产菌株，对其进行发酵培养，从中分离纯化高纯度的ZEN，将为ZEN的分析检测提供来源，也为深入研究ZEN及其开发利用提供物质基础。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一株木贼镰刀菌(Fusariumequiseti)L1293，其保藏编号为CGMCCNO.19032，该菌株已于2019年12月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.19032，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。另一方面本专利技术还提供了木贼镰刀菌(F.equiseti)L1293在制备制备玉米赤霉烯酮中的应用。本专利技术提供的保藏编号为CGMCCNO.19032的木贼镰刀菌(F.equiseti)L1293具有高效玉米赤霉烯酮合成能力，其发酵提取物中含有高达43.8％玉米赤霉烯酮(ZEN/发酵提取物比)。附图说明图1为菌株L1293的菌落和厚垣孢子形态图。图2为菌株L1293粗提物与标准品ZEN的HPLC对照图。图3为菌株L1293粗提物中ZEN的MS图。图4为化合物玉米赤霉烯酮(ZEN)的氢谱。具体实施方式下面将结合实施例对本专利技术的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本专利技术的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本专利技术的宗旨和精神的情况下，可以对本专利技术进行各种修改和替换。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。本实施例所得菌株，通过常规筛选方式从污染粮食中筛选所得，因此本实施例就该菌株的筛选获得过程简要介绍说明如下。样品来源：污染粮食(包括小麦、玉米、大米、高粱和花生)来自河南省，2019年10月采集完成后，所采集的污染粮食置于密闭的无菌塑料袋中于4℃保存，并在1周内进行菌株分离。实施例1、菌株L1293的分离与鉴定菌株分离自河南新郑市污染玉米。称取10g玉米种子，放入75％酒精中浸泡15～20s，然后移入100mL无菌水中，振摇30min，放入25℃恒温箱中培养4～5d，当玉米种子周围长出菌丝体或种子表面有霉层时，将菌丝或霉层移入PDA培养基上，在25℃恒温下进行培养。每天检查培养基，对单菌落进行分离纯化，获得纯化菌株得13株纯菌株。将13株纯菌株用接种针挑至PDA培养基平板中央，25℃培养箱中培养。13株纯菌株在PDA培养基上生长良好，菌落形状圆形，米白色至淡黄色，气生菌丝较短，棉絮状；后期，菌落颜色加深，中央呈黑色。大型分生孢子呈月牙形，3～7个分隔，分隔明显，顶孢呈锥形，大小为40～70×4.5～5.0μm；厚垣孢子顶生，成串状或成结状。提取13株纯菌株的基因组DNA，对其ITS、TEF和RPB2序列进行了PCR扩增和测序，与GenBank数据库中序列进行比对，采用Neighbour-joining法建立了系统发育树，结果表明13株纯菌株与木贼镰刀菌(Fusariumequiseti)的相似性为100％，如序列表1-3所示。结合其形态学特征判断，最终确定为木贼镰刀菌(Fusariumequiseti)L1293，以下在本申请中简称为菌株L1293。菌株L1293已于2019年12月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.19032，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。实施例2、利用菌株L1293制备玉米赤霉烯酮(ZEN)(1)制备菌株L1293的种子液将菌株L1293在PDA平皿中25℃培养3天，然后挑取菌丝块接种于装有100ml种子培养基(PDB培养基)的300ml三角瓶中，25℃震荡培养3天作为种子液。(2)制备菌株L1293固体发酵培养物将种子液5ml接入装有小麦培养基的500ml三角瓶(80g玉米碴/100ml蒸馏水，121℃灭菌20分钟所得)中，25℃黑暗中培养3周，得到菌株L1293固体发酵培养物，发酵规模20瓶。(3)制备体积比为10:1的氯仿-甲醇梯度洗脱液将发酵培养物55-58℃烘干，称重(1250g)，粉碎，用2L乙酸乙酯超声提取3次，合并提取液减压浓缩得到提取物(45.1g)；采用正相硅胶层析分离方法，用依次以100:1、20:1、10:1、5:1和1:1的氯仿-甲醇(v/v)溶剂进行梯度洗脱(每个比列洗脱1.5L)，每300mL收集一管，然后35℃旋转蒸发仪减压浓缩，对各流份进行TLC薄层分析，其中10:1比例洗脱流份进行收集和分析，并对对含有蓝绿色荧光流份(254nm)进行合并。(4)纯化并重结晶得高纯度玉米赤霉烯酮合并10:1的氯仿-甲醇梯度洗脱液并浓缩后采用LH-20凝胶色谱进一步纯化，得到毒素粗提物，再经乙腈重结晶，得到纯度99％以上玉米赤霉烯酮(ZEN)。玉米赤霉烯酮(ZEN)[1]，白色晶体，HRESIMSm/z319.1537[M+H]+(calcd.for319.1540)，分子式为C18H22O5。1HNMR(CDCl3,500MHz)δ:12.05[1H,s,H-6(OH)],7.02(1H,d,J＝15.3Hz,H-7),6.40(1H,d,J＝2.5Hz,H-3),6.34(1H,d,J＝2.5Hz,H-1),5.68(1H,ddd,J＝3.6,10.53,&15.3Hz,H-8),5.23[1H,s,H-2(OH)],5.00(1H,multiplet,H-16),2.85(1H,multiplet,H-13a),2.61(1H,multiplet,H-11a),2.37(1H,multiplet,H-13b),2.22(1H,multiplet,H-11b),2.18(2H,multiplet,H-9),2.16(1H,multiplet,H-15a),2.13(1H,multiplet,H-10a),1.78(1H,multiplet,H-15b),1.73(1H,multiplet,H-10b),1.66(1H,multiplet,H-10b),1.62(1H,multiplet,H-14a),1.50(1H,multiplet,H-14b),1.39(3H,d,J＝6.2Hz,H3-18)。化合物玉米赤霉烯酮(本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一株木贼镰刀菌(Fusarium equiseti)L1293，其保藏编号为CGMCC NO.19032。/n

【技术特征摘要】
1.一株木贼镰刀菌(Fusariumequiseti)L1293，其保藏编号为CGMCCNO.19032。


2.根据权利要求1中所述的木贼镰刀菌(Fusariumequiseti)L1293在制备玉米赤霉烯酮中的应用。


3.根据权利要求2中所述的应用，其特征在于，所述玉米赤霉烯酮的结构式为：


4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述制备玉米赤霉烯酮的方法包括如下步骤：
制备菌株L1293的种子液；
制备菌株L1293固体发酵培养物；
制备体积比为10:1的氯仿-甲醇梯度洗脱液；
纯化并重结晶得高纯度玉米赤霉烯酮。


5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述制备菌株L1293的种子液的方法包括：
将菌株L1293在PDA平皿中25℃培养3天，然后挑取菌丝块接种于装有100ml种子培养基的300ml三角瓶中，25℃震荡培...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘宏伟，韩俊杰，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11