一种聚丙烯酰胺修饰的温敏共聚物的制备方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种聚丙烯酰胺修饰的温敏共聚物的制备方法及其应用，本发明专利技术以异丙基丙烯酰胺为基础，利用PAAm和PEG修饰合成了PEG‑NIPAAm‑PAAm温敏材料，将该温敏材料接枝于聚苯乙烯细胞培养板上形成温敏薄膜。利用该温敏薄膜细胞培养板培养细胞，通过控制温度，改变温敏薄膜的亲水‑疏水性质，实现通过温度控制细胞吸附生长和保留细胞外基质的细胞片完整脱附；本发明专利技术使用阳离子聚合物PAAm、PEG与NIPAAm交联，制备出的材料不仅具有良好的温敏特性，保证细胞片能够在低温下保留完整的细胞外基质脱附，保持细胞的活性的功能；本发明专利技术将PAAm与4‑叠氮苯甲酸连接，使得PAAm与NIPPAm共聚后具有光活性，使制备得到的温敏材料仅需通过紫外光照射即可共价接枝于PSt细胞培养板上，接枝方式无需贵重仪器，简便快捷。

【技术实现步骤摘要】
一种聚丙烯酰胺修饰的温敏共聚物的制备方法及其应用
本专利技术涉及组织工程
，具体地，涉及一种聚丙烯酰胺修饰的温敏共聚物的制备方法及其应用。
技术介绍
由于疾病、损伤和发育缺陷，世界上每年都有大量的人罹患终末期器官衰竭，这已经成为重要的经济和医疗保健问题。器官移植是临床上最有效的治疗方式。在中国，每年大约有30万病人需要器官移植，但只有大约1万人能够得到移植，器官供体缺口巨大，这很大程度限制了器官移植对终末期器官衰竭的治疗范围。同时器官移植后可能出现的免疫排斥限制了器官移植对终末期器官衰竭的治疗效果。Langer等在1993年首次应用生命科学和工程学的原理和方法提出了组织工程技术以恢复、维持或改善组织功能。组织工程的基本原理是将细胞播散到一个可降解的三维支架中，用于替代生物组织受损或丢失的组织，重建生物组织，这给终末期器官衰竭患者带来了新的治疗方案。组织工程已被广泛应用于骨组织缺损修复，软骨组织修复，肝脏损伤修复，心脏瓣膜修复和血管修复和皮肤等。传统的组织工程时常使用胰酶或胶原蛋白酶来分解细胞外基质以获取培养的细胞，但此方式会破坏细胞的细胞外基质(Extracellularmatrix，ECM)，如胶原蛋白、纤连蛋白、整合素和钙黏素家族等，影响收获细胞再培养时形成良好的间隙连接。细胞膜上的钙粘蛋白家族，为细胞骨架蛋白与细胞外基质的连接提供锚点，被胰酶破坏后会影响细胞迁移和细胞粘附。此外组织工程方法中支架的生物降解常导致炎症反应。几乎所有的支架材料在植入后都可引起非特异性的炎症反应。在创口愈合的早期阶段，炎症反应将破坏接种的种子细胞，从而导致组织工程构建的失败。因此构建一种不需要引入酶进行消化的细胞培养技术被人们所期望。1990年日本的NorikoY和TeruoO等人首次使用表面接有聚异丙基丙烯酰胺(Poly(N-isopropylacrylamide)，PNIPAAm或PIPAAm)的聚苯乙烯(Polystyrene，PSt)培养皿培养牛肝细胞，将温度作为细胞吸附和脱附的开关，通过改变培养温度来控制细胞粘附和细胞脱离((YamadaN,OkanoT,SakaiH,etal.Thermo-responsivepolymericsurfaces；controlofattachmentanddetachmentofculturedcells[J].MacromolecularRapidCommunications,1990,11(11):571-576.)。这项技术被称为细胞片层工程(CellSheetEngineering)，实现了无需引入的酶类物质即可完成细胞的脱落，避免了酶类物质对体外培养的细胞的损害。PNIPAAm现在已经是一种研究充分的温敏材料，其在水溶液中的构象是温度响应的。在低温时PNIPAAm溶解在水中，当温度升高时，PNIPAAm从水溶液中分离出来，并且这种相变是可逆的。发生这种相变的温度被称为低临界溶解温度(Lowercriticalsolutiontemperature，LCST)，PNIPAAm的LCST约为32℃。利用PNIPAAm的这种温敏性质，将其接枝于细胞培养皿上形成一层温敏膜，当温度高于LCST时，表面的PNIPAAm膜变为脱水的紧密的疏水性构象，这将有利于细胞在其表面吸附生长。但温度下降到LCST之下，温敏膜变为水合舒展的亲水性构象，这有利于贴壁细胞完整的脱附，细胞薄片还保留下完整的细胞外基质，它们在将细胞薄片转移到其他培养材料或其他细胞薄片上时起着理想的黏附作用。而使用酶解的方法，细胞外的细胞外基质被破坏，细胞单独释放，粘附作用大大降低。PNIPAAm的相变行为是由于PNIPAAm侧链中同时含有疏水性的异丙基(CH-(CH3)2)和亲水性的酰胺基(-CONH-)。当温度较低时，PNIPAAm水溶液中亲水性酰胺基通过氢键与水分子结合，使得水分子扩散进入PNIPAAm高分子中，使其发生溶胀行为，体积增大。当温度较高时，疏水基团异丙基疏水作用增强，分子间的氢键发生断裂，酰胺基与水分子的结合减少，PNIPAAm高分子收缩，形成沉淀析出。Akiyama等人利用接枝了PNIPAAm的聚苯丙烯板上培养牛劲动脉内皮细胞，当温度由37℃降至20℃时，收获了细胞片层。LeiY等人也利用此方法研究了人宫颈癌细胞(HeLa细胞)和人胚胎肾细胞(HEK293)在温敏薄膜上的吸附和脱落，发现在不使用任何酶的情况下，实现了有效的细胞增殖和收获。YuQ等人发现接枝了PNIPAAm的聚乙烯板可能拥有良好的血液相容性。KenichiN合成了基于PNIPAAm热敏阴离子聚合物刷，利用人主动脉平滑肌细胞(SMC)和人脐静脉内皮细胞(HUVEC)在细胞粘附和分离性能上的差异，只需改变温度即可分离HUVEC和SMC的混合物。但是，研究表明并非所有以PNIPAAm为基底的细胞培养板都适合用于细胞培养和收获。聚合物的制备方法、接枝厚度，和其它功能材料的比例等参数均会改变细胞培养基底的表面润湿性和微观结构，从而影响细胞的粘附和后续的生长。通过修饰其他物质可以调节材料的LCST，亲水共聚物会使PNIPAAm的LCST向更高的温度移动，疏水共聚物则相反。通过修饰其他物质也可以改变材料对贴壁细胞的脱附速度，OliverE将聚乙二醇(PEG)引入PNIPAAm，分别制备了含PEG质量分数为15％和19％的两种温敏材料，将它们接枝于金载玻片并用其培养小鼠成纤维细胞(L929)，发现含19％PEG的温敏材料上细胞脱附的时间是含15％PEG的材料的一半。通过细胞片层工程收获的细胞薄片，由于不需要蛋白水解酶，即使在分离后，基底表面细胞外基质蛋白也得以保存，并产生一种基本的构建块，可以进一步操纵它来组装更复杂的组织和器官。细胞片层工程已经在临床实验上有大量的应用，尤其是作为技术的先驱者，TeruoO的团队利用细胞片层工程重建组织做了大量临床试验。其中包括了眼角膜重建、食管溃疡的治疗、心脏修复、肝再生、肺漏气封胶和牙周组织再生等。其他团队也用了细胞片层工程取得临床成功。这些临床试验的成功都说明了细胞片层工程正展现出其在再生医学中潜在的巨大作用。阳离子聚合物聚丙烯酰胺(Polyallylamine，PAAm)分子具有大量伯胺基团。前期研究发现接种于携带正电荷的PSt-AzPhPAAm-IGF-1/TNF-α材料上的骨髓间充质干细胞，21天后几乎未被检测到β-半乳糖苷酶的表达，MTT法检测表明细胞具有较好的活性，SOD基因表达的mRNA表达水平显著提高。这说明正电荷的PSt-AzPhPAAm-IGF-1/TNF-α材料具有抑制骨髓间充质干细胞衰老的作用(YangR,WuL,ChenJ,etal.EffectsofDifferentiationandAnti-SenescencefromBMSCstoHepatocy-LikeCellsofthePAAm-IGF/TNF-αBiomaterial[J].AcsAppliedMaterials&Interfaces,2016:10377-10386.)。但目前仍没有人对本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种聚丙烯酰胺修饰的温敏共聚物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：/nS1.四氢呋喃的丙烯酰氯溶液，缓慢滴入PEG和三乙胺的混合液，充分反应，去除沉淀，降温得到沉淀，取沉淀干燥，得到PEG-AC；/nS2.四氢呋喃的丙烯酰氯溶液，缓慢滴入聚丙烯酰胺和三乙胺的混合液，充分反应，去除沉淀，降温得到沉淀，取沉淀干燥，得到PAAm-AC；/nS3.将N-异丙基丙烯酰胺、PEG-AC和PAAm-AC的异丁醇溶液与偶氮二异丁腈混合，没有气体的条件下充分反应，纯化干燥得到PEG-NIPAAm-PAAm；/nS4.将PEG-NIPAAm-PAAm和4-叠氮基苯甲酸在1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的活化下，在2-吗啉代乙磺酸缓冲溶液充分反应，离心弃上清，避光干燥即得PEG-NIPAAm-AZPhPAAm。/n

【技术特征摘要】
1.一种聚丙烯酰胺修饰的温敏共聚物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.四氢呋喃的丙烯酰氯溶液，缓慢滴入PEG和三乙胺的混合液，充分反应，去除沉淀，降温得到沉淀，取沉淀干燥，得到PEG-AC；
S2.四氢呋喃的丙烯酰氯溶液，缓慢滴入聚丙烯酰胺和三乙胺的混合液，充分反应，去除沉淀，降温得到沉淀，取沉淀干燥，得到PAAm-AC；
S3.将N-异丙基丙烯酰胺、PEG-AC和PAAm-AC的异丁醇溶液与偶氮二异丁腈混合，没有气体的条件下充分反应，纯化干燥得到PEG-NIPAAm-PAAm；
S4.将PEG-NIPAAm-PAAm和4-叠氮基苯甲酸在1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的活化下，在2-吗啉代乙磺酸缓冲溶液充分反应，离心弃上清，避光干燥即得PEG-NIPAAm-AZPhPAAm。


2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S1中，丙烯酰氯：PEG：三乙胺的质量比为9～27：200：10～30。


3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S2中，丙烯酰氯：聚丙烯酰胺：...

【专利技术属性】
技术研发人员：关燕清，薛瀚，赵梓炜，王娜，
申请(专利权)人：华南师范大学，
类型：发明
国别省市：广东;44