检测生理活性物质的方法以及检测工具技术

本发明专利技术公开了一种检测生理活性物质的方法以及一种用于检测生理活性物质的检测工具。检测生理活性物质的方法包括：通过生物酶催化样本中的生理活性物质产生颜色变化引发物，以获得并且显示检测结果。本发明专利技术提出的检测生理活性物质的方法及其应用，打破一般的检测需要使用医学仪器的限制并且做法便利容易。

【技术实现步骤摘要】
检测生理活性物质的方法以及检测工具
本专利技术属于生物科学领域，具体涉及一种通过生物酶催化反应在体外或者离体检测生理活性物质的方法以及相关的检测工具，特别涉及检测烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法及其应用。
技术介绍
生物体内存在各种执行重要生理功能的物质。例如烟酰胺腺嘌呤二核苷酸等生理活性物质为生物中最重要的辅酶，存在于所有生物之中。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸主要为人体内各细胞的生物反应中传送氢离子；在细胞呼吸反应如糖酵解、糖异生等，以至DNA修复和粒线体的调控也与烟酰胺腺嘌呤二核苷酸有直接相连的关系。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸还参与生物体中的大部分生化反应，并为多种重要基因如SIRTUINS1-7和PARP等的反应底物，启动这些基因的基本功能。早于一世纪前，科学家已从酿酒过程中发现烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的存在，并经过多年的研究深入了解烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的结构、形态变化和对生物的作用和重要性。近年研究发现人体内的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的会随年岁增长和疾病而大幅减少；身体内的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸在下降时可诱发多种与新陈代谢衰退的顽疾如二型糖尿病、与脑退化有关的认知障碍症和因基因收复机制失效而引致的癌症等。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸可因年龄差异、身体状况变化、饮食方式、以至日常活动等出现各种变化。目前显示或检测诸如烟酰胺腺嘌呤二核苷酸等生理活性物质的方法可以为使用医疗级光谱仪测定的显色法以及利用高效液相色谱和质谱进行的浓度检测。这些方法虽然能有效地准确检测体内的生理活性物质(如烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)，但需要使用价格高昂的仪器和聘用专业人士进行分析，加上检测方法复杂及耗时，不为如血压量度和血糖检测般便利并且可以由用户在家中每天自我进行。这些原因都有妨碍检测体内的重要生理活性物质的普及化，长远来说大众未能从这些生理活性物质预测身体的病变、生理变化或衰老情况，对公共健康构成障碍。本领域中需要提出一种体外检测生物体内重要生理活性物质的新方法及其应用，为大众认识和了解生理活性物质在体内的变化、预测健康状况及其重要性提供便利的桥梁。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术提供了一种通过生物酶催化反应在体外或者离体检测生理活性物质的方法以及相关的检测工具，特别是检测烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法及其应用。本专利技术所提出的方法是以生物酶催化反应为基础并结合显色法的一套检测生理活性物质(如烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)的方法，可以使用用户的离体样本(如血清或体液)在家中通过专利技术中所提出的方法和工具自行进行生理活性物质(如烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)的评估，为生理活性物质(如烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)检测的做法带来前所未有的便利。具体而言，本专利技术提供了：1.一种检测生理活性物质的方法，包括：通过生物酶催化样本中的生理活性物质产生颜色变化引发物，以获得并且显示检测结果。其中所述生理活性物质选自烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，其包括还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和/或氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸。优选地，所述颜色变化引发物选自过氧化氢。其中所述方法包括在反应试剂的存在下，使用混合生物酶催化生理活性物质产生颜色变化引发物以获得检测结果。任选地，所述混合生物酶的用量为0.5-10000U,优选为1-200U，更优选为1-50U；其中U为每1mg的生物酶在pH6和摄氏25度的环境下每1min催化生成1nmol产物。其中所述检测结果基于还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的摩尔浓度总和。其中所述的显示检测结果包括采用显色物质促使颜色变化引发物发生颜色变化，并且将颜色变化与标准进行对比，优选地，所述显色物质选自显色剂、显色试纸、显色凝胶、显色树脂、显色膜和固定所述显色剂的惰性物料中的至少一者，以及任选地，所述对比包括将颜色变化输入电子设备，并且利用计算机程序自动显示检测结果。其中所述的样本为来自生物体的血液、血清、体液或其组合，优选为血液、尿液、血清和唾液，更优选为血清。其中所述混合生物酶包含以氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸转化至还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的氧化还原酶类，具体包含甲酸脱氢酶(EC1.17.1.9)、葡萄糖脱氢酶(EC1.1.1.47)、木糖醇脱氢酶(E1.1.1.9)和5’磷酸肌苷脱氢酶(EC1.1.1.205)中的至少一种，优选包含甲酸脱氢酶(EC1.17.1.9)、葡萄糖脱氢酶(EC1.1.1.47)或木糖醇脱氢酶(EC1.1.1.9)，更优选包含甲酸脱氢酶(EC1.17.1.9)；任选地，所述混合生物酶还同时包括还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化酶(EC1.6.3.3)，并且所述反应试剂包含所述的一类氧化还原酶类的氢离子供体作为底物，具体包含甲酸或其衍生物、葡萄糖、木糖醇和5’磷酸肌苷中的至少一者，优选甲酸或其衍生物、葡萄糖和木糖醇，更优选为甲酸或其衍生物；任选地，所述反应试剂还包含三羟甲基氨基甲烷、磷酸钠盐和磷酸钾盐中的至少一者。其中所述方法包括在反应试剂的存在下，同时加入甲酸脱氢酶和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化酶，以催化生理活性物质生成过氧化氢。其中所述方法在下列条件下进行：pH6.0-8.0，优选为pH6.5-7.8，更优选为pH7.5–7；并且温度为20-40℃，优选为25-39℃，更优选为35-39℃。其中所述方法包括同时进行下列反应：(1)氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸通过甲酸脱氢酶反应生成还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸；(2)以反应生成的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸为底物通过还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化酶与反应溶液中的氧离子和水酶法反应生成为氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和过氧化氢；(3)期间生成的过氧化氢与显色物质进行化学显色反应，而氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸则同时被甲酸脱氢酶还原成还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，整个酶组合的共同运作组成一个循环链式反应。其中所述的显色剂为靛酚类配合物；任选地，所述显色剂使用化学和物理方法固定于惰性固体材料、纤维材料或其组合的载体中；任选地，所述载体的形状是颗粒状、块状、柱状、片状或条带状；并且任选地，所述显色包括在液体样本中加入显色剂，从而在液体中进显色反应或者加入检测液体中过氧化氢浓度的显色测试纸。其中所述的显示检测结果包括通过生物酶催化反应产生颜色变化引发物(优选过氧化氢)并且与显色物质进行不可逆转的化学反应，其中该化学反应因颜色变化引发物的含量所不同而呈现可观察的颜色变化，并且任选地，所述显色物质选自显色剂、显色试纸、显色凝胶、显色树脂、显色膜和固定有所述显色剂的惰性物料中的至少一者。其中所述的颜色变化为原始颜色与反应后呈现颜色的对比变化；原始颜色分别优选为无色、黄色和红色，更优选为无色；反应后呈现的颜色分别优选为蓝色、绿色和紫色，更优选为蓝色。其中所述的颜色变化包括在载体上以线条、充填色的比例、各种图形所显示的数量、对比色的强度或者软件程序上显示的颜色变化来表示样本中的生理活性物质的量。其中所述的检测结果包括以“高、中、低或检测不到生理活性物质”作本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测生理活性物质的方法，包括：通过生物酶催化样本中的生理活性物质产生颜色变化引发物，以获得并且显示检测结果。/n

【技术特征摘要】
1.一种检测生理活性物质的方法，包括：通过生物酶催化样本中的生理活性物质产生颜色变化引发物，以获得并且显示检测结果。


2.根据权利要求1所述的方法，其中所述生理活性物质选自烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸包括还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和/或氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸；
优选地，所述颜色变化引发物选自过氧化氢。


3.根据权利要求1-2中任意一项所述的方法，其中所述方法包括在反应试剂的存在下，使用混合生物酶催化生理活性物质产生颜色变化引发物以获得检测结果；以及
任选地，所述混合生物酶的用量为0.5-10000U,优选为1-200U，更优选为1-50U；其中U是指每1mg的生物酶在pH6和摄氏25度的环境下每1min催化生成1nmol产物。


4.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其中所述检测结果基于还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的摩尔浓度总和。


5.根据权利要求1-4中任意一项所述的方法，其中所述的显示检测结果包括采用显色物质促使颜色变化引发物发生颜色变化，并且将颜色变化与标准进行对比，
优选地，所述显色物质选自显色剂、显色试纸、显色凝胶、显色树脂、显色膜和固定所述显色剂的惰性物料中的至少一者，以及
任选地，所述对比包括将颜色变化输入电子设备，并且利用计算机程序自动显示检测结果。


6.根据权利要求1-5中任意一项所述的方法，其中所述的样本为来自生物体的血液、血清、体液或其组合，优选为血液、尿液、血清和唾液，更优选为血清。


7.根据权利要求3所述的方法，其中所述混合生物酶包含以氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸转化至还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的氧化还原酶类，具体包含甲酸脱氢酶(EC1.17.1.9)、葡萄糖脱氢酶(EC1.1.1.47)、木糖醇脱氢酶(E1.1.1.9)和5’磷酸肌苷脱氢酶(EC1.1.1.205)中的至少一种，优选包含甲酸脱氢酶(EC1.17.1.9)、葡萄糖脱氢酶(EC1.1.1.47)或木糖醇脱氢酶(EC1.1.1.9)，更优选包含甲酸脱氢酶(EC1.17.1.9)；
任选地，所述混合生物酶还包含还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化酶(EC1.6.3.3)，并且
所述反应试剂包含所述的一类氧化还原酶类的氢离子供体作为底物，具体包含甲酸或其衍生物、葡萄糖、木糖醇和5’磷酸肌苷中的至少一者，优选甲酸或其衍生物、葡萄糖和木糖醇，更优选为甲酸或其衍生物；
任选地，所述反应试剂还包含三羟甲基氨基甲烷、磷酸钠盐和磷酸钾盐中的至少一者。


8.根据权利要求1-7中任意一项所述的方法，其中所述方法包括在反应试剂的存在下，同时加入甲酸脱氢酶和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化酶，以催化生理活性物质生成过氧化氢。


9.根据权利要求1-8中任意一项所述的方法，其中所述方法在下列条件下进行：pH6.0-8.0，优选为pH6.5-7.8，更优选为pH7.5–7；并且温度为20-40℃，优选为25-39℃，更优选为35-39℃。


10.根据权利要求1-9中任意一项所述的方法，其中所述方法包括同时进行下列反应：(1)氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸通过甲酸脱氢酶反应生成还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸；(2)以反应生成的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸为底物通过还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化酶与反应溶液中的氧离子和水酶法反应生成为氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和过氧化氢；(3)期间生成的过氧化氢与显色物质进行化学显色反应，而氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸则同时被甲酸脱氢酶还原成还原型烟酰胺腺...

【专利技术属性】
技术研发人员：潘永强，卢锦春，吴易桄，王骏，
申请(专利权)人：百瑞全球有限公司，
类型：发明
国别省市：英国;GB