基于线粒体基因转录本差异鉴别红麻不同胞质的方法和应用技术

本发明专利技术属于分子遗传学领域，涉及红麻植株不同胞质的鉴别，特别是指基于线粒体基因转录本差异鉴别红麻不同胞质的方法和应用。方法为：称取待鉴别红麻花药，并提取RNA；将提取的RNA进行自连后形成RNA环化产物；将环化产物反转录成cDNA；设计目的线粒体基因已知序列的5’端3’端反向巢氏引物，进行两轮反向巢氏PCR，经凝胶电泳检测后，回收第二轮巢氏PCR产物进行测序；将测序结果与目的线粒体基因的CDS保守区域进行对比分析，获得目的线粒体基因的CDS全长、及5’至3’端转录本全长；对线粒体基因的CDS全长和/或转录本全长的序列特点进行分析，鉴别红麻不同类型的胞质。本发明专利技术还可应用于目的基因在不同材料处理、或不同品种间转录本丰度和转录本末端的比较研究。

【技术实现步骤摘要】
基于线粒体基因转录本差异鉴别红麻不同胞质的方法和应用
本专利技术属于分子遗传学领域，涉及红麻植株不同胞质的鉴别，特别是指基于线粒体基因转录本差异鉴别红麻不同胞质的方法和应用。
技术介绍
目的基因全长获取和转录本特征分析是基因功能研究和表达调控的前提基础。近年来，全基因组测序和转录组测序为生物体基因的特征分析和表达分析调控研究提供了良好的技术方法，但是对于绝大多数生物而言，尚未获得全基因组序列，某些基因的全长序列也未知；通过转录组方式研究单个目的基因的表达调控成本过高，而且转录组数据中存在大量与目的基因表达不相关的冗余信息。传统方法通过RACE试剂盒或TAIR-PCR获取目的基因序列，由于RACE试剂盒昂贵、成本高，步骤繁琐，易使mRNA在操作过程中损失或降解；TAIR-PCR方法只有一端是基因特异引物，而另一端是随机简并引物，PCR扩增产物成功率较低、特异性不强等特点，很难满足后续实验需求。WestonBlot是研究基因转录本表达的传统方法，但该方法操作周期长、步骤繁琐，并且对一些低丰度表达的转录本难以精确检测；此外，WestonBlot方法也无法对所检测基因的转录本条带进行回收测序分析。专利CN201110195025.8公开了利用巢式PCR结合基因特异引物的反转录技术挖掘低丰度表达基因和系统鉴定剪接变体的方法与应用，该方法基于3’GSP1的反转录PCR，利用梯度PCR寻找每个基因每对引物组合的最佳退火温度，基于GSP的巢式PCR测序并基于序列分析判定是否为新的剪接变体。基于现有的研究可知，扩增目的基因的全长的方法有多种，而且研究人员在现有方法的基础上针对要解决的技术问题，往往需要对方法进行改进。本申请为解决如何通过线粒体基因转录本差异来鉴别红麻不同胞质的技术问题，对现有的技术方法，进行了改进和摸索。
技术实现思路
为解决上述技术问题，本专利技术提出一种基于线粒体基因转录本差异鉴别红麻不同胞质的方法和应用。本专利技术的技术方案是这样实现的：基于线粒体基因转录本差异鉴别红麻不同胞质的方法，步骤为：（1）称取待鉴别红麻花药，并提取RNA；（2）将步骤（1）提取的RNA进行环化处理，然后RNA环化产物反转录形成cDNA；（3）在目的线粒体基因保守区域的5’和3’端分别设计两对反向巢氏引物，进行两轮反向巢氏PCR，经凝胶电泳检测后，将第二轮巢氏PCR产物进行回收测序；（4）将测序结果与目的线粒体基因的CDS保守区域进行对比分析，通过ORFfinder在线软件和同源序列比对分析获得目的线粒体基因的CDS全长、及该线粒体基因的5’至3’端转录本全长；（5）对步骤（4）获得的线粒体基因的CDS全长和/或5’至3’端转录本全长的序列特点进行分析，鉴别红麻不同胞质。所述步骤（3）中目的线粒体基因为atp1，atp9和cox3，在进行反向巢氏PCR时，第一轮巢氏PCR以距离目的基因保守区域5’和3’端边界较远的两条引物进行扩增，第二轮巢氏PCR以距离目的基因保守区域5’和3’端边界较近的两条引物进行扩增。所述目的线粒体基因为atp1时，距离目的基因保守区域5’和3’端边界较远的两条引物分别为atp1-AP1和atp1-SP1、距离目的基因保守区域5’和3’端边界较近的两条引物分别为atp1-AP2和atp1-SP2，其中atp1-AP1序列为5’-CGATCTCATCCACTTGAAAATTCGT-3’，atp1-AP2序列为5’-TTAGTTCTGCAGCTCTGGGAGAGA-3’，atp1-SP1序列为5’-GGCTTACAGAAGTACCGAAACAACC-3’，atp1-SP2序列为5’-GGATTCTGTGATCGAATGCCATTAG-3’。所述目的线粒体基因为atp9时，距离目的基因保守区域5’和3’端边界较远的两条引物分别为atp9-AP1和atp9-SP1、距离目的基因保守区域5’和3’端边界较近的两条引物分别为atp9-AP2和atp9-SP2，其中atp9-AP1序列为5’-GCACCCATTAATTTTGCACCTTC-3’，atp9-AP2序列为5’-ATTCTCGTCACGCGCTTTATCATTC-3’，atp9-SP1序列为5’-ATTTTGGGCTTTGCTCTAACCGAAG-3’，atp9-SP2序列为5’-GAAGCTATTGCATTGTTTGCCCTAA-3’。所述目的线粒体基因为cox3时，距离目的基因保守区域5’和3’端边界较远的两条引物分别为cox3-AP1和cox3-SP1、距离目的基因保守区域5’和3’端边界较近的两条引物分别为cox3-AP2和cox3-SP2，其中cox3-AP1序列为5’-GCCCAAACTGAGAAGTCTTGCAC-3’，cox3-AP2序列为5’-CCACTTTGCCTCGGTTGTATGTAA-3’，cox3-SP1序列为5’-GGTCATCTGACTAAAGAGCATCACG-3’，cox3-SP2序列为5’-GCATTTTGTAGACGTGGTTCGG-3’。所述步骤（3）中反向巢氏PCR反应体系如下：在20μL反应体系中含10μL2×PhantaMaxMasterMix（南京诺唯赞），0.6μMAP引物，0.6μMSP引物，50ng模板，加ddH2O至总体积为20μL；扩增程序为：95℃预变性3min，95℃变性30sec，58-60℃退火30sec，72℃延伸1min，反应循环数设为35，72℃延伸5min，4℃保存。所述步骤（5）中鉴别红麻不同胞的标准为：以atp1为线粒体目的基因时，atp1在不育系胞质中扩增出三条特异条带，在保持系胞质中只有一条特异条带，而在F1胞质中有两条特异条带；以atp9为线粒体目的基因时，以atp9为线粒体目的基因时，在不育系中扩增出一条大小为400bp的特异条带，在保持系和F1代中扩增的特异条带大小为450bp；以cox3为线粒体目的基因时，cox3在不育系胞质中扩增出5条特异条带，且弱带均在两主带之间，在保持系中只有一条特异条带，在F1代中有两条相邻的主带。上述的方法在分析/鉴别atp1，atp9或cox3基因CDS全长的应用。上述的方法在分析/鉴别atp1，atp9或cox3基因在红麻待测胞质中转录本大小差异的应用。上述的方法在分析/鉴定atp1，atp9或cox3基因在红麻不同胞质中转录本丰度（转录本条带亮度）差异的应用。上述的方法在分析/鉴定atp1，atp9或cox3基因在红麻不同胞质中5’和3’转录本末端差异的应用。上述的方法在分析/鉴定atp1，atp9或cox3基因在红麻待测胞质中是否受核质互作调控中的应用。本专利技术具有以下有益效果：1、本专利技术基于mRNA的5’端磷酸基团和3’端羟基在RNA链接酶的作用下自连形成环状结构，在反转录酶的作用下合成cDNA，以该cDNA为模板利用反向巢氏PCR方法进行PCR扩增获得目的序列，该方法不仅能获得目的基本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.基于线粒体基因转录本差异鉴别红麻不同胞质的方法，其特征在于，步骤为：/n（1）称取待鉴别红麻花药，并提取RNA；/n（2）将步骤（1）提取的RNA进行环化处理，然后对RNA环化产物进行反转录形成cDNA；/n（3）在目的线粒体基因保守区域的5’和3’端分别设计两对反向巢氏引物，进行两轮反向巢氏PCR，经凝胶电泳检测后，将第二轮巢氏PCR产物进行回收测序；/n（4）将测序结果与目的线粒体基因的CDS保守区域进行对比分析，通过ORF finder在线软件以及同源序列比对获得目的线粒体基因的CDS全长、及该线粒体基因的5’至3’端转录本全长；/n（5）对步骤（4）获得的线粒体基因的CDS全长和/或5’至3’端转录本全长的序列特点进行分析，鉴别红麻不同胞质。/n

【技术特征摘要】
1.基于线粒体基因转录本差异鉴别红麻不同胞质的方法，其特征在于，步骤为：
（1）称取待鉴别红麻花药，并提取RNA；
（2）将步骤（1）提取的RNA进行环化处理，然后对RNA环化产物进行反转录形成cDNA；
（3）在目的线粒体基因保守区域的5’和3’端分别设计两对反向巢氏引物，进行两轮反向巢氏PCR，经凝胶电泳检测后，将第二轮巢氏PCR产物进行回收测序；
（4）将测序结果与目的线粒体基因的CDS保守区域进行对比分析，通过ORFfinder在线软件以及同源序列比对获得目的线粒体基因的CDS全长、及该线粒体基因的5’至3’端转录本全长；
（5）对步骤（4）获得的线粒体基因的CDS全长和/或5’至3’端转录本全长的序列特点进行分析，鉴别红麻不同胞质。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（3）中目的线粒体基因为atp1，atp9和cox3，在进行反向巢氏PCR时，第一轮巢氏PCR以距离目的基因保守区域5’和3’端边界较远的两条引物进行扩增，第二轮巢氏PCR以距离目的基因保守区域5’和3’端边界较近的两条引物进行扩增。


3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述目的线粒体基因为atp1时，距离目的基因保守区域5’和3’端边界较远的两条引物分别为atp1-AP1和atp1-SP1、距离目的基因保守区域5’和3’端边界较近的两条引物分别为atp1-AP2和atp1-SP2，其中atp1-Ap1序列为5’-CGATCTCATCCACTTGAAAATTCGT-3’，atp1-AP2序列为5’-TTAGTTCTGCAGCTCTGGGAGAGA-3’，atp1-SP1序列为5’-GGCTTACAGAAGTACCGAAACAACC-3’，atp1-SP2序列为5’-GGATTCTGTGATCGAATGCCATTAG-3’。


4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述目的线粒体基因为atp9时，距离目的基因保守区域5’和3’端边界较远的两条引物分别为atp9-AP1和atp9-SP1、距离目的基因保守区域5’和3’端边界较近的两条引物分别为atp9-AP2和atp9-SP2，其中atp9-AP1序列为5’-GCACCCATTAATTTTGCACCTTC-3’，atp9-AP2序列为5’-ATTCTCGTCACGCGCTTTATCATTC-3’，atp9-SP1序列为5’-ATTTTGGGCTTTGCTCTAACCGAAG-...

【专利技术属性】
技术研发人员：廖小芳，唐兴富，赵艳红，侯文焕，
申请(专利权)人：广西壮族自治区农业科学院，
类型：发明
国别省市：广西;45