用于美洲黑杨和小叶杨种间杂交子代的鉴别引物和鉴定方法技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，具体而言，提供了一种用于美洲黑杨和小叶杨种间杂交子代的鉴别引物和鉴定方法。本发明专利技术提供的用于美洲黑杨和小叶杨种间杂交子代的鉴别引物，包括含有SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的(a)引物对和/或含有SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4的(b)引物对。该鉴别引物扩增产物在美洲黑杨和小叶杨两个物种中长度存在特异性，可单独使用其中一对引物进行鉴定，两对引物同时使用可以提高鉴别的准确性。此外，使用此引物进行鉴别可以直接排除花粉污染等造成的错误检测结果。

【技术实现步骤摘要】
用于美洲黑杨和小叶杨种间杂交子代的鉴别引物和鉴定方法
本专利技术涉及生物
，具体而言，涉及一种用于美洲黑杨和小叶杨种间杂交子代的鉴别引物和鉴定方法。
技术介绍
杨树是杨属(Populus)树种的统称，杨树具有生长快、成材早、产量高、易于更新等特点。杂交是林木遗传育种中最常用且最有效的方法。杨树的杂交已有100多年的历史，并选育出一批速生、抗病虫的优良品种而广泛应用于林业生产。杂交育种仍然是目前及今后更长时间培育杨树新品种的重要手段。远缘杂交可以把亲本双方的基因组整体融合，即把一个基因组有利性状的基因导入到另外一个树种中去，可以培育出速生、抗病虫、抗逆性强的新品种。种间杂交授粉过程中，由于室外套袋授粉容易引起种内花粉的污染，而杨树的选育周期较长，因此对杨树苗期杂交子代的真实性鉴定，对杨树种间杂交速生、抗病虫、抗逆等优良性状品种的选育具有重要的意义。目前，杨树种间杂交子代鉴别技术主要有以下几种。(1)形态学标记：缺点是自然突变等获得具有特定形态特征所需的时间较长，遗传表达不稳定，表型还容易受环境条件的影响，因此，简便性和准确性远远不够；(2)细胞学标记：缺点是在杨树细胞学研究方面，目前研究只在染色体数目和核型分析层面，没有开发出对远缘杂交子代鉴定的细胞学标记；(3)生化标记：缺点是由于翻译后的修饰作用、组织特异性和发育的阶段性，特别是多态性位点较少，以及染色方法使用放射性材料，电泳条件因酶而异需要逐个调整，且谱带受材料和环境影响较大，鉴定结果不容易令人信服，因此其使用受到了一定的限制；(4)DNA分子标记：以植物DNA为研究对象，从植物基因组水平检测特异性DNA片段的长度多态性，可以准确鉴定植物种、无性系以及品种，且检测不受植物发育时间的限制，也避免环境变化对植物的影响，从而提高了鉴别的准确性。DNA分子标记主要包括RFLP、RAPD、ISSR、AFLP、SSR和SNP这几种。RFLP标记具有共显性的特点，能够区别纯合与杂合基因型，不受显隐关系、环境条件和发育条件的影响，可以提供单个位点上的较完整的信息。然而RFLP分子标记技术在实际的推广应用过程中仍然存在缺陷，标记数量少，其操作技术也较为复杂，采用的放射性标记对人体有害等缺点，因而很难被广泛的应用于植物品种遗传鉴别。RAPD和ISSR都是显性分子标记，由于引物是一段较短的随机序列，因此扩增检测结果容易受外源DNA污染的影响，扩增重复性和稳定性较差，从而严重影响鉴别结果的可靠性。AFLP标记也是以PCR为基础来检测DNA限制性片段的长度多态性，结合了RFLP和RAPD两种分子标记技术的特点，具有多态性高、重复性强等特点。根据孟德尔遗传定律，AFLP标记可以用于种间杂交子代的鉴别。采用AFLP标记进行子代真实性鉴别时，首先需要将亲本和子代的DNA进行酶切、然后连接接头、预扩增和选择性扩增等，最后需要采用毛细管电泳检测，AFLP检测操作复杂，耗时耗力。SSR分子标记是一类由2～6核苷酸为串联重复单位组成串联重复序列，广泛分布于动植物的基因组中。SSR标记主要具有数量丰富、呈共显性遗传、扩增的特异性高、重复性好等优点，在广泛应用于植物的品种鉴别中。如张红莲(2010)等采用SSR对鹅掌楸属及其杂种鉴定时，从176对引物中只筛选出了1对引物可用于鹅掌楸种间杂交子代的鉴定。物种特异性的SSR分子标记开发耗时耗力，而且效率很低。单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphisms，简称SNP)，是指基因组水平的单个核苷酸变异引起的DNA序列多态性。SNP是一种二态的标记，由单个碱基的转换或颠换所引起，也可由碱基的插入或缺失所致。SNP标记广泛存在于动植物的基因组中，这些多态性可能是由于RFLP引起的，也可能是SSR变异引起的，但90％以上的差异是由SNP造成的，因此SNP作为第三代遗传标记进行研究显得尤为重要。随着第二代、第三代测序技术的飞速发展，使在全基因组水平上开发SNP标记成为可能。SNP作为新一代分子标记，逐渐被广泛的应用于遗传学的各个领域，也为植物品种分子鉴别、分子标记辅助选择育种等研究提供一种重要的工具。目前，国内外基于杨树种间杂交分子鉴别的研究较少。在杨树分子鉴别方面，Rahman(2002)等采用10个SSR位点对美洲黑杨、欧洲黑杨、香脂杨、毛果杨、大齿杨和辽杨的96个无性系进行鉴别，刘海琳(2017)等采用了10个SSR位点，对美洲黑杨的43个无性系进行鉴别，而上述这些研究只是对杨树种间个体进行区分。叶培忠(1959)等对杨树派间进行了大量的杂交实验，但对这些杂交子代的真实性判断仅限于形态学上的差异。彭儒胜(2018)等对美洲黑杨和山杨进行了正反交，但也只采用了形态学进行了杂交子代的鉴定。李毅等(2002)以箭杆杨为母本和胡杨进行杂交，采用了RAPD标记对子代进行鉴别，确定了子代是箭杆杨和胡杨的杂种。杨成超(2015)等采用AFLP技术对银白杨和白榆科间杂交进行了鉴定。而上述这些鉴别采用的都是常规的显性分子标记检测技术(如图1所示)，如果污染花粉和杂交父本基因型相同，那么种间杂交子代和污染花粉杂交子代相同，因此不能确定杂交是否为真实的，从而容易导致鉴别结果的可信度低。有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的第一目的在于提供一种用于美洲黑杨和小叶杨种间杂交子代的鉴别引物。本专利技术的第二目的在于提供鉴别引物在鉴定美洲黑杨和小叶杨种间杂交子代或制备用于鉴定美洲黑杨和小叶杨种间杂交子代的产品中应用。本专利技术的第三目的在于提供一种试剂或试剂盒。本专利技术的第四目的在于提供一种鉴别美洲黑杨和小叶杨种间杂交子代的方法。为了实现本专利技术的上述目的，特采用以下技术方案：一种用于美洲黑杨和小叶杨种间杂交子代的鉴别引物，所述鉴别引物包括如下(a)和/或(b)：(a)Chr2_1F：5’-TTGTGCCTTTTTGTTTCACG-3’(SEQIDNO.1)；Chr2_1R：5’-TGAACAAAAGCCACCATAGC-3’(SEQIDNO.2)；(b)Chr13_14F：5’-GGTGACCTTCATCGTGAAAAA-3’(SEQIDNO.3)；Chr13_14R：5’-AGCCCCACATGTGCATACTT-3’(SEQIDNO.4)。上述的鉴别引物在鉴定美洲黑杨和小叶杨种间杂交子代中的应用。上述的鉴别引物在制备用于鉴定美洲黑杨和小叶杨种间杂交子代的产品中应用。进一步地，所述产品包括试剂或试剂盒。一种试剂，包括上述的鉴别引物。一种试剂盒，包括上述的鉴别引物或试剂。一种鉴别美洲黑杨和小叶杨种间杂交子代的方法，利用上述的鉴别引物对目标基因组进行PCR扩增，检测扩增产物，出现两条带为美洲黑杨和小叶杨种间杂交子代。进一步地，(a)的鉴别引物：扩增产物出现一条128bp的条带，目标基因组为美洲黑杨；扩增产物出现一条139bp的条带，目标基因组为小叶杨。进一步地，(b)的鉴别引本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于美洲黑杨和小叶杨种间杂交子代的鉴别引物，其特征在于，所述鉴别引物包括如下(a)和/或(b)：/n(a)Chr2_1F：5’-TTGTGCCTTTTTGTTTCACG-3’(SEQ ID NO.1)；/nChr2_1R：5’-TGAACAAAAGCCACCATAGC-3’(SEQ ID NO.2)；/n(b)Chr13_14F：5’-GGTGACCTTCATCGTGAAAAA-3’(SEQ ID NO.3)；/nChr13_14R：5’-AGCCCCACATGTGCATACTT-3’(SEQ ID NO.4)。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于美洲黑杨和小叶杨种间杂交子代的鉴别引物，其特征在于，所述鉴别引物包括如下(a)和/或(b)：
(a)Chr2_1F：5’-TTGTGCCTTTTTGTTTCACG-3’(SEQIDNO.1)；
Chr2_1R：5’-TGAACAAAAGCCACCATAGC-3’(SEQIDNO.2)；
(b)Chr13_14F：5’-GGTGACCTTCATCGTGAAAAA-3’(SEQIDNO.3)；
Chr13_14R：5’-AGCCCCACATGTGCATACTT-3’(SEQIDNO.4)。


2.权利要求1所述的鉴别引物在鉴定美洲黑杨和小叶杨种间杂交子代中的应用。


3.权利要求1所述的鉴别引物在制备用于鉴定美洲黑杨和小叶杨种间杂交子代的产品中应用。


4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，...

【专利技术属性】
技术研发人员：戴晓港，尹佟明，薛良交，陈晨，吴怀通，房芝馨，
申请(专利权)人：南京林业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32