一种病原耐药基因的存在及表达情况的共检测方法技术

本发明专利技术提供了一种病原耐药基因的存在及表达情况的共检测方法。所述共检测方法使用的反转录随机引物5'端包含固定碱基和随机碱基，用于区分DNA和RNA；所述共检测方法包括：样本核酸的提取、反转录、片段化处理和连接测序接头等文库构建步骤，再对所得文库进行宏基因组测序或捕获测序，进而得到病原耐药基因的存在情况和表达情况。所述共检测方法无论是通过宏基因组测序还是捕获测序，都可以通过单次实验测序得到耐药相关基因在DNA和RNA两个层面的测序数据，对指导临床用药具有更加重要的意义。

【技术实现步骤摘要】
一种病原耐药基因的存在及表达情况的共检测方法
本专利技术属于微生物检测
，具体涉及一种病原耐药基因的存在及表达情况的共检测方法，尤其涉及一种基于二代测序平台共检测耐药基因的存在及表达情况的方法。
技术介绍
抗菌药物（抗生素）通过杀灭细菌发挥治疗感染的作用，包括β-内酰胺类、氨基糖苷类、四环素类、氟喹诺酮类、叶酸途径抑制剂类、多肽类和大环内酯类等，在治疗时需根据不同的感染性疾病进行合理选择。细菌作为一类广泛存在的生物体，可以通过多种形式获得对抗菌药物的抵抗作用，逃避被杀灭的危险，这种抵抗作用被称为“细菌耐药”（DrugResistance），获得耐药能力的细菌就被称为“耐药菌”。耐药菌对人类健康构成重大威胁，其常出现在医疗机构内，医院科室中内、外科均以大肠埃希菌（Escherichiacoli）检出率最高，而ICU最常见病原菌是鲍曼不动杆菌（Acinetobacterbaumannii），且ICU耐药率普遍高于非ICU。同时，越来越多的同一菌株携带多种耐药基因，这也进一步警示人们要合理地使用抗菌药物。目前，临床常用的针对耐药菌的耐药基因检测方法主要是两种：1、药敏鉴定，该方法虽然是耐药基因检测的金标准，但是存在需要培养，鉴定周期长，灵敏度不高等缺点；2、荧光PCR，相较于药敏鉴定，虽然不依赖培养，提高了灵敏度，但也存在通量不高限制，一次只能检测几个耐药位点等问题。宏基因组测序技术（mNGS）作为一种无差别测序方法，也可以应用于临床病原抗生素耐药基因检测和分析。但是，目前mNGS在临床方面的反馈效果并不理想，主要原因包括基因碎片化过于严重导致漏检或者检测到的片段临床意义不明确等问题。靶向测序（Targetsequencing）是一种对感兴趣的基因或区域进行特异富集并测序的方法，包括多重扩增测序法和探针捕获测序法两种方式。使用靶向探针捕获抗生素耐药基因或位点的高通量测序法来检测耐药基因已成为一个有潜力的方法。该方法和多重扩增测序法相比有以下几个优势：1、捕获探针的设计难度低于多重扩增；2、探针捕获的覆盖区域大，可以一次性捕获检测更多的耐药相关基因；3、部分耐药基因存在序列相似度高的特点，特别是归属于同一耐药基因家族的不同成员，如果使用多重扩增测序法难度较大。目前为止，尚未开发出一种既能检测耐药基因片段是否存在又能够同时检测耐药基因转录表达情况的测序方法。
技术实现思路
针对现有技术存在的不足，本专利技术的目的在于提供一种病原耐药基因的存在及表达情况的共检测方法。所述方法通过单次实验测序即可得到耐药相关基因在DNA和RNA两个层面的测序数据，既能够检测耐药基因片段是否存在、又能够同时检测耐药基因转录表达情况。为达此目的，本专利技术采用以下技术方案：第一方面，本专利技术提供一种用于检测病原耐药基因的存在及表达情况的反转录随机引物，所述反转录随机引物包括5~10个随机碱基和2~5个固定碱基，所述固定碱基包括ACT。由于RNA需要进行反转录步骤操作生成cDNA，所以，在测序序列含有固定碱基标记的序列，其原始序列均为RNA。本专利技术中，使用固定碱基ACT进行标记，可以防止其与其他扩增得到的测序序列混淆，区分度较高，反转录结束后就可以与核酸中的DNA合并打断建库和测序。本专利技术中，所述反转录随机引物中随机碱基的个数可以为5个、6个、7个、8个、9个或者10个，固定碱基的个数可以为2个、3个、4个或者5个。同时，本专利技术中，固定碱基的选择不考虑三者完全相同的碱基，如AAA，CCC等，其会影响引物整体的GC含量，也会影响引物的碱基复杂度；且本专利技术中，选择的固定碱基为ACT，其反转录后共检测的效果最好。本专利技术中，所述固定碱基可以直接位于5'末端，或者与5'末端间隔若干个随机碱基；其中，优选为间隔1个随机碱基。优选地，所述反转录随机引物自5'端起依次包括1~2个随机碱基、3个固定碱基和5~8个随机碱基。优选地，所述反转录随机引物的序列如SEQIDNO.1所示，具体为：5'-NACTNNNNNN-3'。随机引物中，N表示随机碱基A、T、G或C中的任意一个。第二方面，本专利技术还包括如第一方面所述的反转录随机引物在实时荧光定量PCR检测、宏基因组测序或捕获测序中的应用。第三方面，本专利技术提供一种病原耐药基因的存在及表达情况的共检测方法，所述共检测方法包括如下步骤：（1）提取样本中的核酸；（2）对步骤（1）所得核酸进行片段化处理；（3）使用第一方面所述的反转录随机引物和逆转录酶对步骤（2）中所得片段化核酸进行反转录，再对片段化的核酸进行末端修复和加A尾，而后连接测序接头，纯化；（4）对步骤（3）所得纯化后的产物进行PCR文库扩增并加index，纯化得到DNA文库；（5）对所得DNA文库进行宏基因组测序，得到病原耐药基因的存在情况和表达情况；或者，将所得DNA文库和捕获探针混合进行文库杂交反应，纯化捕获片段，再对所述纯化后的捕获片段进行二代高通量测序，获得病原耐药基因的存在情况和表达情况。需要注意的是，本专利技术中所述“样本”或“样品”是指需要进行检测分析的物质，其可以来自于个体（如人或动物，更具体地如全血、血浆、唾液、脑髓液、关节液、痰液、肺泡灌洗液、尿液、粪便、腹胸腹水或组织等），也可以是其它来源的，例如一些经处理或未经处理的实验室材料，或人工合成的测试品。应理解，对“样本”或“样品”的检测并非仅涉及诊断目的，还可涉及其它非诊断目的。作为本专利技术优选的技术方案，步骤（5）所述捕获探针检测的基因包括vanA、KPC、NDM-1、IMP、IMI、VIM、IND、SME-1、embB、ethA、gyrA、katG、ahpC、panD、pncA、murM、rpoB、rpsA、CTX-M、rpsL、rrs、tetM、mecA、mecB、mecC、CAU-1、FEZ-1、CphA、Sfh-1、OXA-2、mcr-1、ACC或MOX中的任意一种或至少两种的组合。本专利技术中上述检测基因对应耐受的药物包括碳青霉烯类、头孢菌素类、甲氧西林类、β-内酰胺类、氟醛诺酮类、多肽类、氨基糖苷类、大环内酯类、四环素类、多粘菌素类或结核相关药物等。作为本专利技术优选的技术方案，步骤（5）所述捕获探针还包含对照探针，所述对照探针用于检测人内源基因，包括GAPDH、ATM、RAD51或β-actin中的任意一种或至少两种的组合。优选地，步骤（5）所述捕获探针带有生物素标记，长度为80~120bp，例如80bp、85bp、90bp、95bp、100bp、105bp、110bp、115bp或120bp等。本专利技术中，所述捕获在目标基因的外显子上均匀分布；同时，本专利技术还对设计的所有探针序列进行比对去除冗余探针，形成bed文件。此外，由于捕获测序在方法学上的优势，本专利技术可以在上述基因的基础上进一步增加捕获基因或者扩大区域范围，进而得到更多的测序信息。作为本专利技术优选的技术方案，步骤（5）所述二代高通量测本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测病原耐药基因的存在及表达情况的反转录随机引物，其特征在于，所述反转录随机引物包括5~10个随机碱基和2~5个固定碱基，所述固定碱基包括ACT。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于检测病原耐药基因的存在及表达情况的反转录随机引物，其特征在于，所述反转录随机引物包括5~10个随机碱基和2~5个固定碱基，所述固定碱基包括ACT。


2.根据权利要求1所述的反转录随机引物，其特征在于，所述反转录随机引物自5'端起依次包括1~2个随机碱基、3个固定碱基和5~8个随机碱基；
所述反转录随机引物的序列为：5'-NACTNNNNNN-3'。


3.如权利要求1或2所述的反转录随机引物在实时荧光定量PCR检测、宏基因组测序或捕获测序中的应用。


4.一种病原耐药基因的存在及表达情况的共检测方法，其特征在于，所述共检测方法包括如下步骤：
（1）提取样本中的核酸，包括DNA和RNA；
（2）对步骤（1）所得核酸进行片段化处理；
（3）使用权利要求1或2中所述的反转录随机引物和逆转录酶对步骤（2）中所得片段化核酸进行反转录，再对片段化的核酸进行末端修复和加A尾，而后连接测序接头，纯化；
（4）对步骤（3）所得纯化后的产物进行PCR文库扩增并加index，纯化得到核酸文库；
（5）对所得核酸文库进行宏基因组测序，得到病原耐药基因的存在情况和表达情况；
或者，将所得核酸文库和捕获探针混合进行文库杂交反应，纯化捕获片段，再对所述纯化后的捕获片段进行二代高通量测序，获得病原耐药基因的存在情况和表达情况。


5.根据权利要求4所述的共检测方法，...

【专利技术属性】
技术研发人员：林东旭，袁光孝，朱方何，向亮，杨懿婧，陈杰，
申请(专利权)人：广州赛哲生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44