一种伤寒沙门氏菌的检测试剂盒、其制备方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种伤寒沙门氏菌的检测试剂盒、其制备方法及其应用，检测试剂盒，包括：扩增引物、crRNA、LbCas12a‑RR蛋白和单链DNA报告系统；crRNA为针对伤寒沙门氏菌flag基因检测区段的特异性crRNA；LbCas12a‑RR蛋白表达的序列为以Cas12蛋白核酸序列进行原核密码子优化，并对532和595位氨基酸分别进行突变为G532R和K595R后的序列；试剂盒的应用，为将伤寒沙门氏菌的检测试剂盒用于伤寒沙门氏菌的核酸检测；该试剂盒灵敏度高、特异性强、快速可视化。

【技术实现步骤摘要】
一种伤寒沙门氏菌的检测试剂盒、其制备方法及其应用
本专利技术涉及一种伤寒沙门氏菌的检测试剂盒、其制备方法及其应用，属于微生物检测

技术介绍
肠沙门菌伤寒血清型(S.Typhi)是一种人类宿主限制性病原体，其引起的伤寒仍然是一个重大的公共卫生问题。据估计，全球每年约1090万人感染伤寒，近10万人因此死亡，其中儿童的感染率最高。伤寒沙门氏菌主要通过被粪便污染的水或食物传播。当患者摄入被污染的食物或水后，伤寒沙门氏菌会侵入肠道粘膜并扩散至全身，引起高热、肝脾肿大、皮疹等急性症状。由于伤寒沙门氏菌引起的症状和体征是非特异性的，很难直接通过临床症状进行诊断，因此，实验室检查对于诊断至关重要。目前实验室用于伤寒诊断的金标准是仍然是细菌分离培养，但是受血液中细菌数量及抗菌药使用的影响，血液培养的阳性率低于骨髓培养。但抽取骨髓会增加患者诊治过程中的感染风险，而且分离培养耗时较长，不利于早期诊断。因而，最常见的诊断方法是血清学的肥达实验。但此实验与其他感染性病原存在严重的交叉反应，如疟疾、登革热、布鲁氏菌病等等，容易产生假阳性结果，导致误诊率增加，而且肥达反应的滴度也因地区和年龄不同而差异很大。因而，在没有详细的背景资料时，单纯的血清学诊断是不准确的，不具有诊断意义。ELISA方法相较于肥达反应来说是一种既灵敏又特异的诊断方法，有文献指出ELISA在检测抗体方面的优势，提出ELISA可以代替肥达反应来监测血清抗体。目前市场上有一些商品化的抗体检测试剂盒，包括Tubextest、Typhidot/Typhidot-M、IgMDipstick，这些试剂盒均以检测IgM为目的，也有着血清学方法的共同缺点，即交叉反应强烈。因而血清学检测对目前使用的抗原尚争议，需要寻找特异性抗原。除了细菌分离培养和血清学检测，核酸检测是目前公认最为敏感和特异的诊断方法。通过PCR进行核酸检测的最大优势是当培养的结果为阴性时，PCR把微量的核酸片段放大，捕捉到细菌的踪迹。但是PCR方法也有一定的缺陷，首先，容易污染；其次，抗生素的滥用加剧了血液中细菌数量的减少，增加了制备样品DNA模板的难度；再次，由于沙门菌属基因组90％以上是相似的，只有个别的碱基差异，因此目前的PCR是多重PCR，但这样复杂的扩增不如在基因组中发掘更多的独有基因。虽然，准确的诊断对于确保患病者得到及时的医疗护理和适当的治疗至关重要。然而，鉴于沙门氏菌生物体独特的挑战性，数年来国际上一直在开发旨在提高成本效益并快速提供准确结果的新诊断工具。在2020年第11届国际伤寒和其他沙门氏菌病会议上提出了通过监测环境中沙门氏菌病原体数量来取代临床监测的新思路。因此，开发快速、高效、便捷的伤寒沙门氏菌检测方法尤为重要。
技术实现思路
为了克服现有技术的不足，本专利技术的第一个目的在于提供一种伤寒沙门氏菌的检测试剂盒，该试剂盒灵敏度高、特异性强、快速可视化。本专利技术的第二个目的在于提供上述伤寒沙门氏菌的检测试剂盒的制备方法，该制备方法简单快捷，适合工业化生产。本专利技术的第三个目的在于提供伤寒沙门氏菌的检测试剂盒的应用，将伤寒沙门氏菌的检测试剂盒用于伤寒沙门氏菌的核酸检测，实现快速可视化检测。实现本专利技术的第一个目的可以通过采取如下技术方案达到：一种伤寒沙门氏菌的检测试剂盒，包括：扩增引物、crRNA、LbCas12a-RR蛋白和单链DNA报告系统；crRNA为针对伤寒沙门氏菌flag基因检测区段的特异性crRNA；LbCas12a-RR蛋白表达的序列为以Cas12蛋白核酸序列进行原核密码子优化，并对532和595位氨基酸分别进行突变为G532R和K595R后的序列。进一步地，扩增引物包括flag-RPA-F2和flag-RPA-R1，flag-RPA-F2的序列如SEQIDNO.1所示，flag-RPA-R1的序列如SEQIDNO.2所示。进一步地，crRNA包括flag-crRNA1和flag-crRNA3；flag-crRNA1的序列如SEQIDNO.3所示，flag-crRNA3的序列如SEQIDNO.4所示。进一步地，单链DNA报告系统包括单链DNAFQreporter；单链DNAFQreporter为利用6-羧基荧光素和荧光淬灭剂标记的单链DNA，标记产物为：/56FAM/TTTATTT/3BHQ1/。实现本专利技术的第二个目的可以通过采取如下技术方案达到：一种伤寒沙门氏菌的检测试剂盒的制备方法，检测试剂盒包括扩增引物、crRNA、LbCas12a-RR蛋白和单链DNA报告系统；其制备方法包括：扩增引物制备步骤：设计包含crRNA的扩增引物；crRNA制备步骤：针对伤寒沙门氏菌flag基因，寻找包含LbCas12a-RR识别序列TTTN或/和TCTN的靶向序列，设计并制备crRNA；LbCas12a-RR蛋白制备步骤：针对Cas12蛋白核酸序列进行原核密码子优化并对532和595位氨基酸分别进行突变为G532R和K595R，得到LbCas12a-RR蛋白表达的序列；然后构建到pET28a表达载体，进行低温诱导可溶蛋白表达，通过亲和纯化和分子筛纯化获得LbCas12a-RR蛋白。进一步地，扩增引物的长度为30-37bp。进一步地，crRNA制备步骤中，crRNA的长度为23bp。实现本专利技术的第三个目的可以通过采取如下技术方案达到：一种伤寒沙门氏菌的检测试剂盒的应用，将伤寒沙门氏菌的检测试剂盒用于伤寒沙门氏菌的核酸检测；检测试剂盒包括扩增引物、crRNA、LbCas12a-RR蛋白和单链DNA报告系统；伤寒沙门氏菌的核酸检测包括：扩增步骤：将扩增引物加入重组酶聚合酶扩增技术体系，以扩增待测样品的核酸，得到扩增产物；检测步骤：将扩增产物加入包括crRNA、LbCas12a-RR蛋白和单链DNA报告系统的检测体系并进行反应，得到检测产物，用荧光检测法进行检测，得到结果。进一步地，扩增步骤中，在温度为37℃的条件下扩增30min，得到扩增产物；检测步骤中，反应的条件为温度37℃，反应时间25min，得到检测产物。进一步地，检测步骤中，荧光检测法为：使用酶标仪测量检测反应的荧光数值，设定检测激发光为485-520nm；或将检测产物置于485nm波长的光源下，直接观察。本专利技术的设计原理如下：CRISPR-Cas(Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats，CRISPRs)是细菌中一种适应性免疫系统，Cas蛋白通过RNA引导的核酸酶靶向降解外来核酸。其中，CRISPR-Cas12a于Cas酶第二家族，用来引导RNA指导双链DNA裂解单个RuvC催化结构域。Cas12酶识别富含胸腺嘧啶(Thymine，T)核苷酸的间隔区相邻基序(PAM)，催化它们自身的指导CRISPRRNA(crRNA)成熟，并特异性识别和切割互补配对的双链DNA(dsDNA)。当CRISPR/Cas12蛋白以序列本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种伤寒沙门氏菌的检测试剂盒，其特征在于包括：扩增引物、crRNA、LbCas12a-RR蛋白和单链DNA报告系统；/n所述crRNA为针对伤寒沙门氏菌flag基因检测区段的特异性crRNA；/n所述LbCas12a-RR蛋白表达的序列为以Cas12蛋白核酸序列进行原核密码子优化，并对532和595位氨基酸分别进行突变为G532R和K595R后的序列。/n

【技术特征摘要】
1.一种伤寒沙门氏菌的检测试剂盒，其特征在于包括：扩增引物、crRNA、LbCas12a-RR蛋白和单链DNA报告系统；
所述crRNA为针对伤寒沙门氏菌flag基因检测区段的特异性crRNA；
所述LbCas12a-RR蛋白表达的序列为以Cas12蛋白核酸序列进行原核密码子优化，并对532和595位氨基酸分别进行突变为G532R和K595R后的序列。


2.如权利要求1所述的伤寒沙门氏菌的检测试剂盒，其特征在于，所述扩增引物包括flag-RPA-F2和flag-RPA-R1，flag-RPA-F2的序列如SEQIDNO.1所示，flag-RPA-R1的序列如SEQIDNO.2所示。


3.如权利要求1所述的伤寒沙门氏菌的检测试剂盒，其特征在于，所述crRNA包括flag-crRNA1和flag-crRNA3；所述flag-crRNA1的序列如SEQIDNO.3所示，所述flag-crRNA3的序列如SEQIDNO.4所示。


4.如权利要求1所述的伤寒沙门氏菌的检测试剂盒，其特征在于，所述单链DNA报告系统包括单链DNAFQreporter；所述单链DNAFQreporter为利用6-羧基荧光素和荧光淬灭剂标记的单链DNA，标记产物为：/56FAM/TTTATTT/3BHQ1/。


5.一种伤寒沙门氏菌的检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述检测试剂盒包括扩增引物、crRNA、LbCas12a-RR蛋白和单链DNA报告系统；其制备方法包括：
扩增引物制备步骤：设计包含crRNA的扩增引物；
crRNA制备步骤：针对伤寒沙门氏菌flag基因，寻找包含LbCas12a-RR识别序列TTTN或/和TCTN的靶向序列，设计并制备crRNA...

【专利技术属性】
技术研发人员：王伟佳，董谦，陈康，王鑫杰，刘鹏，谢晋烨，李洋，耿逸云，刘馨怡，王娟，冯砚平，
申请(专利权)人：王伟佳，袁勇，
类型：发明
国别省市：广东;44