一种简化DNA甲基化文库及转录组共测序文库的构建方法技术

本发明专利技术公开了一种简化DNA甲基化文库及转录组共测序文库的构建方法，包括如下步骤：步骤一，细胞样本准备；步骤二，将gDNA和mRNA分离；步骤三，将mRNA反转录成cDNA，再对cDNA进行文库富集和定量；步骤四，cDNA采用转座法进行文库构建后再PCR孵育；步骤五，准备测序文库；步骤六，限制性内切酶消化；步骤七，末端修复和加碱基“A”；步骤八，采用DNA连接酶连接甲基化接头；步骤九，亚硫酸氢盐转化甲基化文库；步骤十，甲基化文库的PCR富集；步骤十一，准备RRBS测序文库；本发明专利技术实现了对同一单细胞进行甲基化和转录组文库构建，提高实验操作便捷性，降低成本，提高了CpG岛的覆盖度。

【技术实现步骤摘要】
一种简化DNA甲基化文库及转录组共测序文库的构建方法
本专利技术涉及分子生物学领域，特别是一种简化DNA甲基化文库及转录组共测序文库的构建方法。
技术介绍
自单细胞转录组的首次报道以来，类似的技术已在大多数生物学领域发展成为核心工具，包括用于分析单细胞的基因组，转录组，表观基因组修饰的各层面的技术。在过去的十年中，一些例子集中在例如剖析细胞异质性，发现异质群体中的罕见细胞，追踪细胞进化以及研究微生物群体的多样性。这些技术的应用大大地扩展了我们对生物学许多领域中基本问题的理解，而对大量样品进行测序则无法回答这些问题。例如，原发肿瘤的单细胞基因组重测序已彻底改变了我们对包括肿瘤内异质性，克隆进化和稀有细胞在肿瘤发展中的作用的理解。为了进一步研究同一单个细胞内多层基因组信息之间的联系，研究人员已开发出测序方法，可同时测量细胞的多种形态。这些方法中包括基因组和转录组，甲基化和转录组，甲基化与染色质组等联合分析等。单细胞“双组学”或“多组学”提高了我们理解组织中细胞类型异质性以及发育过程中细胞分化的特性。可以预见的是，这些技术将在未来的许多研究领域，包括癌症，免疫学，神经生物学和微生物学中发挥重要的作用。市场需要一种能够实现了从同一单个细胞中完成甲基化组和转录组共测序的技术方案，且具有实验操作便捷性、低成本和CpG覆盖位点广的共测序文库的构建方法，本专利技术解决这样的问题。
技术实现思路
为解决现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种简化DNA甲基化文库及转录组共测序文库的构建方法，实现了对同一单细胞进行甲基化和转录组文库构建，不仅解决了细胞异质性的问题，且使得实验操作便捷的同时还降低了每个样本的建库成本，通过对不同片段大小的文库进行分开测序，大大提高了CpG岛的覆盖度。为了实现上述目标，本专利技术采用如下的技术方案：一种简化DNA甲基化文库及转录组共测序文库的构建方法，包括如下步骤：步骤一，细胞样本裂解，释放基因组DNA和RNA；步骤二，将gDNA和mRNA分离；步骤三，将mRNA反转录成cDNA，再对cDNA进行文库富集和定量；步骤四，cDNA采用转座反应混合物得到反应体系，再对反应体系进行PCR孵育；步骤五，将同一个库集的PCR产物经过纯化、洗脱、文库DNA质控、再根据所需数据量进行等比例摩尔量混合文库；步骤六，限制性内切酶消化gDNA；步骤七，DNA末端修复以及将dATP掺入平末端DNA片段的3′端；步骤八，采用DNA连接酶连接甲基化接头；甲基化接头为两条单链核酸退火后形成的Y型双链结构，其中所有的胞嘧啶核苷酸都是甲基化的；Y型双链结构的底部核酸链的5’端做磷酸化处理；Y型双链结构的3’端是一个具有6个核苷酸的标签序列；步骤九，亚硫酸氢盐转化甲基化文库；步骤十，甲基化文库的PCR富集；步骤十一，将同一个库集的PCR产物进行纯化、洗脱、染色、切胶回收条带DNA、纯化去除PCR引物二聚体后洗脱得到最终文库DNA，质控后对相同条带大小的文库根据所需的数据量进行等比例摩尔量混合，将两种片段大小混合后的文库在Illumina测序平台上进行100bp双末端测序，上样量按照Illumina文库的80-85％密度进行簇生成，混合的测序文库掺入15％-20％的phiX平衡文库。前述的一种简化DNA甲基化文库及转录组共测序文库的构建方法，步骤一中的细胞样本为单细胞或多细胞样本。前述的一种简化DNA甲基化文库及转录组共测序文库的构建方法，步骤二中，分离gDNA和mRNA采用生物素标记的反转录引物为：5’-BiotinTEG-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN-SEQID01。前述的一种简化DNA甲基化文库及转录组共测序文库的构建方法，步骤三中，反转录采用的反转录酶为SuperScriptIIRT，反转录的接头序列是5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACrGrG+G-SEQID02，其中包含2个核糖核苷酸和1个3’端封闭的核苷酸；cDNA的扩增引物为5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-SEQID16。前述的一种简化DNA甲基化文库及转录组共测序文库的构建方法，步骤三中，对cDNA进行文库富集采用的cDNA的扩增引物为5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-SEQID16；文库定量采用安捷伦HS高敏芯片测定文库DNA片段大小和摩尔浓度，或是采用Qubitfluorometer的dsDNAhigh-sensitivitykit进行文库定量。前述的一种简化DNA甲基化文库及转录组共测序文库的构建方法，步骤六中的限制性内切酶为MspI或HaeIII的一种或几种的组合。前述的一种简化DNA甲基化文库及转录组共测序文库的构建方法，步骤七中DNA末端修复以及将dATP掺入平末端DNA片段的3′端采用的酶为缺失3’-5’外切酶活性的KlenowExo-酶。前述的一种简化DNA甲基化文库及转录组共测序文库的构建方法，步骤八中的DNA连接酶为T4DNA连接酶。前述的一种简化DNA甲基化文库及转录组共测序文库的构建方法，步骤八中甲基化接头为Y型接头，甲基化接头1的序列为：补充，甲基化接头2的序列为：前述的一种简化DNA甲基化文库及转录组共测序文库的构建方法，步骤九中，亚硫酸氢盐转化甲基化文库使用的亚硫酸氢盐转化试剂盒为QiaGenEpiTectfastbisulfiteconversionkit；使用两个循环的亚硫酸氢盐方案，具体如下所示：前述的一种简化DNA甲基化文库及转录组共测序文库的构建方法，步骤十中，甲基化文库的PCR扩增使用的酶为2xKAPAHiFiHotStartUracil+ReadyMix。前述的一种简化DNA甲基化文库及转录组共测序文库的构建方法，步骤十一中，将同一个库集的PCR产物进行纯化使用的是1.3X稀释的AgencourtAMPureXP磁珠；AgencourtAMPureXP磁珠用4倍体积的缓冲液稀释，缓冲液成分为10％PEG/1MNaCl，0.5％TritonX1-00。前述的一种简化DNA甲基化文库及转录组共测序文库的构建方法，步骤十一中，切胶回收条带DNA使用3％NuSieve3:1agaroseTBE-gel进行凝胶电泳和切胶回收，分别对每一个混合样本切胶回收条带在170-400bp和400-800bp的DNA片段。前述的一种简化DNA甲基化文库及转录组共测序文库的构建方法，步骤十一中去除PCR引物二聚体纯化采用QiaGengelpurificationkit试剂盒对切胶回收的文库进行纯化。前述的一种简化DNA甲基化文库及转录组共测序文库的构建方法，其特征在于，步骤十一中，质控采用Agilent高敏芯片对文库大小和浓度进行质控。本专利技术的有益之处在于：本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种简化DNA甲基化文库及转录组共测序文库的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：/n步骤一，细胞样本裂解，释放基因组DNA和RNA；/n步骤二，将gDNA和mRNA分离；/n步骤三，将mRNA反转录成cDNA，再对cDNA进行文库富集和定量；/n步骤四，cDNA采用转座反应混合物得到反应体系，再对反应体系进行PCR孵育；/n步骤五，将同一个库集的PCR产物经过纯化、洗脱、文库DNA质控、再根据所需数据量进行等比例摩尔量混合文库；/n步骤六，限制性内切酶消化gDNA；/n步骤七，DNA末端修复以及将dATP掺入平末端DNA片段的3′端；/n步骤八，采用DNA连接酶连接甲基化接头；/n所述甲基化接头为两条单链核酸退火后形成的Y型双链结构，其中所有的胞嘧啶核苷酸都是甲基化的；所述Y型双链结构的底部核酸链的5’端做磷酸化处理；所述Y型双链结构的3’端是一个具有6个核苷酸的标签序列；/n步骤九，亚硫酸氢盐转化甲基化文库；/n步骤十，甲基化文库的PCR富集；/n步骤十一，将同一个库集的PCR产物进行纯化、洗脱、染色、切胶回收条带DNA、纯化去除PCR引物二聚体后洗脱得到最终文库DNA，质控后对相同条带大小的文库根据所需的数据量进行等比例摩尔量混合，将两种片段大小混合后的文库在Illumina测序平台上进行100bp双末端测序，上样量按照Illumina文库的80-85％密度进行簇生成，混合的测序文库掺入15％-20％的phiX平衡文库。/n...

【技术特征摘要】
1.一种简化DNA甲基化文库及转录组共测序文库的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一，细胞样本裂解，释放基因组DNA和RNA；
步骤二，将gDNA和mRNA分离；
步骤三，将mRNA反转录成cDNA，再对cDNA进行文库富集和定量；
步骤四，cDNA采用转座反应混合物得到反应体系，再对反应体系进行PCR孵育；
步骤五，将同一个库集的PCR产物经过纯化、洗脱、文库DNA质控、再根据所需数据量进行等比例摩尔量混合文库；
步骤六，限制性内切酶消化gDNA；
步骤七，DNA末端修复以及将dATP掺入平末端DNA片段的3′端；
步骤八，采用DNA连接酶连接甲基化接头；
所述甲基化接头为两条单链核酸退火后形成的Y型双链结构，其中所有的胞嘧啶核苷酸都是甲基化的；所述Y型双链结构的底部核酸链的5’端做磷酸化处理；所述Y型双链结构的3’端是一个具有6个核苷酸的标签序列；
步骤九，亚硫酸氢盐转化甲基化文库；
步骤十，甲基化文库的PCR富集；
步骤十一，将同一个库集的PCR产物进行纯化、洗脱、染色、切胶回收条带DNA、纯化去除PCR引物二聚体后洗脱得到最终文库DNA，质控后对相同条带大小的文库根据所需的数据量进行等比例摩尔量混合，将两种片段大小混合后的文库在Illumina测序平台上进行100bp双末端测序，上样量按照Illumina文库的80-85％密度进行簇生成，混合的测序文库掺入15％-20％的phiX平衡文库。


2.根据权利要求1所述的一种简化DNA甲基化文库及转录组共测序文库的构建方法，其特征在于，步骤一中的细胞样本为单细胞或多细胞样本。


3.根据权利要求1所述的一种简化DNA甲基化文库及转录组共测序文库的构建方法，其特征在于，步骤二中，分离gDNA和mRNA采用生物素标记的反转录引物为：5’-BiotinTEG-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN-SEQID01。


4.根据权利要求1所述的一种简化DNA甲基化文库及转录组共测序文库的构建方法，其特征在于，步骤三中，反转录采用的反转录酶为SuperScriptIIRT，反转录的接头序列是5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACrGrG+G-SEQID02，其中包含2个核糖核苷酸和1个3’端封闭的核苷酸；cDNA的扩增引物为5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-SEQID16。


5.根据权利要求1所述的一种简化DNA甲基化文库及转录组共测序文库的构建方法，其特征在于，步骤三中，对cDNA进行文库富集采用的cDNA的扩增引物为5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-SEQID16；文库定量采用安捷伦HS高敏芯片测定文库DNA片段大小和摩尔浓度，或是采用Qubit...

【专利技术属性】
技术研发人员：谷红仓，钱飞箭，王云飞，车仙荣，
申请(专利权)人：杭州圣庭医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33