一种筛选肿瘤抗原特异性TCR序列的方法技术

本发明专利技术公开了一种筛选肿瘤抗原特异性TCR序列的方法，包括步骤：1)处理肿瘤组织，获取细胞悬液；2)单细胞转录组测序；3)测序所得数据转换成细胞‑基因的表达矩阵；4)标准化整合表达矩阵的数据并进行细胞分群，筛选同时高表达肿瘤标签基因与T细胞标签基因的目标细胞；5)获取步骤4)所得目标细胞的TCR基因序列。单细胞转录组测序技术过程中会出现两个或以上细胞进入一个反应体系的情况，这时测序结果会显示只有一个细胞，而实质是两个或多个细胞，这种情况被称作双/多胞体。当肿瘤细胞与T细胞特异性结合时，也会产生双/多胞体。利用该现象可筛选出同时表达了肿瘤标签基因与T细胞标签基因的目标细胞，进而提取TCR序列。

【技术实现步骤摘要】
一种筛选肿瘤抗原特异性TCR序列的方法
本专利技术涉及生物检测
，特别涉及一种筛选肿瘤抗原特异性TCR序列的方法。
技术介绍
近年来，肿瘤的免疫治疗取得了巨大进展，免疫治疗成为继传统手术、放疗和化疗之后的第四种肿瘤治疗方式。其旨在激活人体免疫系统，依靠自身免疫机能杀灭癌细胞和肿瘤组织。过继性免疫细胞治疗(Adoptivecellulartherapy,ACT)属于肿瘤免疫治疗的重要组成部分，主要是通过向患者回输在体外扩增的自身或同种(特异性或非特异性)免疫细胞，从而达到抗肿瘤目的，体外筛查肿瘤抗原特异性TCR序列成为该治疗手段的关键点。肿瘤免疫治疗发展迅速，靶向PD-1/PD-L1或CTLA-4药物的使用，已被证明对多种恶性肿瘤有明显疗效，但是部分癌种中的部分患者能够获得持续的疗效，大多数患者对免疫抑制剂治疗反应性不好，更有甚者在治疗一段时间后出现耐药性或者肿瘤超进展。因此，亟需开发新的个体化精准免疫治疗策略，提高肿瘤患者的存活率和存活时间。T细胞受体(Tcellreceptor,TCR)是T细胞特异性识别和结合抗原肽-MHC分子的分子结构，通常与CD3分子呈复合物形式存在于T细胞表面。大多数T细胞的TCR由α和β肽链组成，少数T细胞的TCR由γ和δ肽链组成。TCR特异性识别抗原提呈细胞上的抗原肽-MHC复合物，进而触发T细胞免疫应答。由于TCR分子决定着T细胞的抗原识别特异性，基于此将肿瘤抗原特异性的TCR基因转入普通T细胞中，赋予该T细胞肿瘤抗原的识别能力，经体外活化增殖后再转输入患者体内，可以发挥抗肿瘤功效，TCR基因修饰的T细胞被称为TCR-T细胞。近年来TCR-T已经成为肿瘤免疫治疗中的研究热点，在临床实验中显示了良好的治疗效果。TCR-T细胞对表达目的抗原的靶细胞具有强大攻击能力，且受MHC限制，寻找肿瘤特异性新抗原成为制备TCR-T细胞的关键点。TCR分子主要由α和β两条链组成，其编码基因V、(D)J、C在T细胞发育过程中经胚系重排，在胸腺中经过阳性选择和阴性选择成为具有MHC识别限制性。机体成熟T细胞所产生的TCRαβ组成了一个能与成千万种抗原结合的抗原识别受体库(Repertoire)，从理论上估计，TCRαβ受体库的容量在1015以上。成功获得肿瘤抗原特异性的TCR是肿瘤TCR-T细胞治疗的重要前提，目前肿瘤特异性TCR基因的筛选主要通过获得肿瘤抗原特异性识别的T细胞，然后克隆其TCR基因。大量研究证实肿瘤的进展与T细胞免疫关系密切，癌组织浸润T细胞的表型、功能和数量与预后密切相关。T细胞介导肿瘤清除需满足三个条件：识别肿瘤并活化，解除免疫抑制，能归巢到肿瘤组织。为了让T细胞识别肿瘤，Eshhar、CarlJune和Rosenberg等科学家们开发了T细胞受体重定向技术(Tcellreceptorredirection)，通过基因工程手段，制备嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)或T细胞受体基因修饰T细胞(TCR-T)，提高对肿瘤的识别和杀伤。CAR-T和TCR-T作为免疫细胞过继回输治疗前沿技术，使得基于合成生物学、免疫学、遗传改造技术获得功能加强型T细胞成为可能。但现有的技术，需首先获取肿瘤抗原，再获取肿瘤特异T细胞，技术步骤繁琐易出错，且无法获得表达该TCR的细胞属于何种状态、何种亚群以及表达何种效应因子，其肿瘤反应性也无法得知，故不利于对TCR序列应用于TCR-T的有效性的评估。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种筛选肿瘤抗原特异性TCR序列的方法，以解决现有技术中所存在的一个或多个技术问题，至少提供一种有益的选择或创造条件。本专利技术提供的筛选肿瘤抗原特异性TCR序列的方法，包括以下步骤：1)处理肿瘤组织，获取细胞悬液(single-cellsuspension)；2)分离所述细胞悬液中的单个细胞，再以单细胞转录组测序技术(single-cellRNA-seq，scRNA-seq)进行测序；3)测序所得数据转换成细胞-基因的表达矩阵；4)标准化整合表达矩阵的数据并进行细胞分群，筛选同时高表达肿瘤标签基因与T细胞标签基因的目标细胞；5)获取步骤4)所得目标细胞的TCR基因序列。以单细胞转录组测序技术法进行的测序步骤中，会出现两个或以上细胞进入一个反应体系的情况，这时测序结果会显示只有一个细胞，而实质是两个或多个细胞，这种情况被称作双/多胞体。当肿瘤细胞与T细胞特异性结合时，也会产生双/多胞体，且数量较多。利用该现象可筛选出同时表达了肿瘤标签基因与T细胞标签基因的目标细胞，进而提取该肿瘤特异的TCR序列。在本专利技术的一些应用实施方式中，步骤1)所述处理的具体过程为：1-1)将肿瘤组织冲洗后去除四周结缔组织和脂肪组织，剪碎成1～2mm3大小的小块；1-2)加入组织消化液混匀，摇床中消化1～2小时后终止消化，经孔径70μm的筛网过滤，然后离心；1-3)弃去上清液，用平衡盐溶液离心洗涤两次；1-4)弃去上清液，加入RPMI-1640完全培养基；1-5)去除死亡细胞，细胞重悬。在本专利技术的一些应用实施方式中，步骤1-2)所述组织消化液包括I型胶原酶15～25mg、10mg/mL的DNA酶8～12μL、RPMI-1640不完全培养基8～12mL。在本专利技术的一些应用实施方式中，步骤1-2)所述离心具体是在常温环境下转速1800rpm，离心8min，离心机离心上升速率设置为7，下降速率设置为4。在本专利技术的一些应用实施方式中，步骤1-3)所述用平衡盐溶液离心洗涤前还包括加入4～5mL红细胞裂解液，轻轻吹散细胞团块，RT静置5～10min，待液体颜色变成清亮透明的状态终止裂解。在本专利技术的一些应用实施方式中，步骤1-3)所述平衡盐溶液选自Hank’s液。在本专利技术的一些应用实施方式中，步骤1-5)所述去除的方法是使用细胞分选磁珠去除死亡细胞，优选使用美天旎磁珠去死细胞磁珠(MiltenyiBiotec,DeadCellRemovalKit,130-090-101)。在本专利技术的一些应用实施方式中，步骤2)所述分离是通过口吸管技术(Micropipettingmicromanipulation)、激光捕获显微切割技术(Lasercapturemicrodissection)、流式细胞仪技术(FluorescenceactivatedCellSorting，FACS)、微滴技术(Microdroplets)或微流体技术(Microfluidics)实现细胞悬液中单个细胞的分离。在本专利技术的一些应用实施方式中，步骤4)所述标准化是利用Seurat(BrodyH.Colorectalcancer.Nature.2015May14；521(7551):S1.doi:10.1038/521S1a)中提供的SCTransform方法标准化并整合各样本的数据。本方法所能够获得的是能够特异性识别肿瘤细胞上的抗原肽-MHC复合物的TCR序列。该TCR序列的应用本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种筛选肿瘤抗原特异性TCR序列的方法，其特征在于，包括以下步骤：/n1)处理肿瘤组织，获取细胞悬液；/n2)分离所述细胞悬液中的单个细胞，再以单细胞转录组测序技术进行测序；/n3)测序所得数据转换成细胞-基因的表达矩阵；/n4)标准化整合表达矩阵的数据并进行细胞分群，筛选同时高表达肿瘤标签基因与T细胞标签基因的目标细胞；/n5)获取步骤4)所得目标细胞的TCR基因序列。/n

【技术特征摘要】
1.一种筛选肿瘤抗原特异性TCR序列的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)处理肿瘤组织，获取细胞悬液；
2)分离所述细胞悬液中的单个细胞，再以单细胞转录组测序技术进行测序；
3)测序所得数据转换成细胞-基因的表达矩阵；
4)标准化整合表达矩阵的数据并进行细胞分群，筛选同时高表达肿瘤标签基因与T细胞标签基因的目标细胞；
5)获取步骤4)所得目标细胞的TCR基因序列。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)所述处理的具体过程为：
1-1)将肿瘤组织冲洗后去除四周结缔组织和脂肪组织，剪碎成1～2mm3大小的小块；
1-2)加入组织消化液混匀，摇床中消化1～2小时后终止消化，经孔径70μm的筛网过滤，然后离心；
1-3)弃去上清液，用平衡盐溶液离心洗涤两次；
1-4)弃去上清液，加入RPMI-1640完全培养基；
1-5)去除死亡细胞，细胞重悬。


3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1-2)所述组织消化液包括I型胶原酶15～25mg、10mg...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗微，毛晓帆，余思菲，林凯容，张贝莹，张楚凌，官展文，金亚彬，
申请(专利权)人：佛山市第一人民医院中山大学附属佛山医院，
类型：发明
国别省市：广东;44