一株耐酸酿酒酵母及其在有机酸制备中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一株耐酸酿酒酵母及其在有机酸制备中的应用。本发明专利技术提供了一株酿酒酵母，所述酿酒酵母保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2021258，保藏日期为2021年3月19日；本发明专利技术定向进化筛选得到酿酒酵母CTPth‑2，耐受最低pH为2.32左右，这也是目前报道的酿酒酵母耐受的最低pH；为验证耐酸底盘细胞酿酒酵母CTPth‑2生产有机酸的潜力，本发明专利技术中以苹果酸为例，强化苹果酸合成的胞质途径，并外源表达来源于粟酒酵母的苹果酸转运蛋白，构建工程菌株CTPM3，在不添加中和剂的条件下，采用摇瓶发酵，苹果酸的发酵产量达到16.5g/L。

【技术实现步骤摘要】
一株耐酸酿酒酵母及其在有机酸制备中的应用
本专利技术涉及一株耐酸酿酒酵母及其在有机酸制备中的应用，属于微生物

技术介绍
有机酸(Organicacid)，特别是短链有机酸(short-chainorganicacid)，近年来广泛用于食品，生物医药，化妆品，洗涤剂，聚合物和纺织品等行业。短链有机酸是低分子量有机化合物，具有一个或多个酸性基团的化合物，其中最典型的是羧酸基团。根据碳原子数，短链有机酸可分为碳二(C2)，碳三(C3)，碳四(C4)，碳五(C5)和碳六(C6)有机酸。通常，C3有机酸包括丙酸，丙酮酸，乳酸和3-羟基丙酸。C4有机酸包括苹果酸，富马酸，琥珀酸酸和丁酸。C5有机酸包括衣康酸，α-酮戊二酸，戊二酸和木糖醛酸，而C6有机酸包括柠檬酸酸，粘康酸(主要是顺式，顺式粘康酸)，葡萄糖酸和己二酸。而苹果酸和乳酸都是比较重要且常见的短链有机酸，其制备方法主要是生物发酵的方法，但是在制备苹果酸和乳酸的过程中，随着有机酸浓度的不断积累，而在反应体系中形成了低pH的环境，严重抑制了微生物的生长，造成有机酸的产量不足。针对上述问题，目前工业上的解决方法是在发酵初始添加碳酸钙或者在发酵过程中添加中和剂；在发酵初始添加碳酸钙时，确实会解决由于反应体系当中的低pH的环境抑制微生物生长，而造成有机酸的产量不足的问题，但是，由于碳酸钙为固体粉末，后期需要进一步的分离去除并且需要对产物进行进一步的纯化，导致工序复杂，并且成本很高。在工业生产中，另一种解决发酵过程中的低pH环境的方法为采用添加中和剂的方式来调节，但是添加的中和剂多是可溶性碱性溶液，容易在发酵培养基中生成盐类物质，后续要先经过酸解，才能进一步的分离、纯化。例如，公开号为CN105400711B的中国专利技术专利当中记载，采用其构建的基因工程菌株能够在温度为30℃，转速800rpm，通气量1.5vvm的条件下得到的苹果酸的产量为27.3g/L，但是在制备过程中需要采用8mM的KOH调节pH至5.0；公开号为CN106190936B的中国专利技术专利当中记载，采用其构建的基因工程菌株能够在温度为30℃，通气量为0.5vvm，搅拌转速为200rpm，发酵过程中，使用25％(w/v)氢氧化钠水溶液作为中和剂调节发酵液pH为7.0。并且其发酵培养基也含有大量的K2SO4、KH2PO4、MgSO4和CaCl2，导致最终生成的产物主要以有机酸盐的形式存在，后续要先经过酸解，才能进一步的分离、纯化。由于酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)具有耐酸性，是一种被广泛用作重要营养化学品的生产宿主，其产品被FDA认证为GRAS(GenerallyRegardedasSafe)安全级别，因此可以作为底盘细胞对其进行改造以得到一种高效生产有机酸的基因工程菌。同时，现有技术当中，采用碱中和的方法，一方面增加了产物分离、纯化的成本和工序，另一方面如果前期添加的中和剂，或者后续酸解所用的酸反应不完全，还会造成资源的浪费和环境的污染。因此，目前急需开发一种耐酸底盘细胞工厂，在不添加或者减少中和剂添加的前提下，应用于有机酸的生产。
技术实现思路
为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一株酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，所述酿酒酵母保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCCM2021258，保藏日期为2021年3月19日。所述酿酒酵母是以酿酒酵母(SaccharomycescerevisiaeCEN.PK2-1C)为出发菌株，第一阶段以苹果酸为选择压力，外源添加不同浓度的苹果酸，定向进化筛选得到耐受更低pH的酿酒酵母突变株；第二阶段以柠檬酸为选择压力，外源添加不同浓度的柠檬酸，定向进化筛选得到耐受更低pH的酿酒酵母突变株；最终得到一株酿酒酵母，命名为酿酒酵母CTPth-2。本专利技术还提供了含有上述酿酒酵母CTPth-2的微生物菌剂。本专利技术还提供了上述酿酒酵母CTPth-2在制备有机酸中的应用。在本专利技术的一种实施方式中，所述应用为，采用上述酿酒酵母CTPth-2作为底盘细胞，对其进行改造，用来制备得到有机酸。在本专利技术的一种实施方式中，所述有机酸包括丙酸、丙酮酸、乳酸、苹果酸、富马酸、琥珀酸酸、丁酸、衣康酸、α-酮戊二酸、戊二酸、木糖醛酸、柠檬酸酸、粘康酸、葡萄糖酸和己二酸。本专利技术还提供了一种基因工程菌，所述基因工程菌以上述酿酒酵母为宿主细胞，过表达了来源于酿酒酵母的MDH3酶和PYC2酶，同时外源表达了来源于粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)的苹果酸转运蛋白SpMAE1。在本专利技术的一种实施方式中，所述MDH3酶的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。在本专利技术的一种实施方式中，编码所述MDH3酶的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述PYC2酶的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。在本专利技术的一种实施方式中，编码所述PYC2酶的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述SpMAE1酶的氨基酸序列如SEQIDNO.5所示在本专利技术的一种实施方式中，编码所述SpMAE1酶的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述基因工程菌以pY26TEF-GPD为表达载体。本专利技术还提供了上述基因工程菌的构建方法，所述方法为：(1)制备重组载体：将苹果酸脱氢酶mdh3ΔSKL(malatedehydrogenase3,mdh3)基因、丙酮酸羧化酶pyc2(pyruvatecarboxylase,pyc2)基因连接在pY26TEF-GPD质粒上，所述苹果酸脱氢酶mdh3ΔSKL为，将苹果酸脱氢酶mdh去除mdh3末端的3个氨基酸SKL；得到的重组载体pY26TEF-GPD-mdh3ΔSKL-pyc2；将来源于粟酒酵母苹果酸转运蛋白SpMAE1基因连接在pRS303质粒上，得到重组载体pRS303-SpMAE1；(2)分别将制备得到的重组载体pY26TEF-GPD-mdh3ΔSKL-pyc2和pRS303-SpMAE1导入宿主细胞酿酒酵母CTPth-2中，制备得到基因工程菌。本专利技术还提供了一种生产苹果酸的方法，采用上述基因工程菌发酵制备得到苹果酸。在本专利技术的一种实施方式中，所述方法为：将上述基因工程菌添加至种子培养基中培养，得到种子液，将种子液接种至发酵培养基中发酵制备苹果酸。在本专利技术的一种实施方式中，所述种子培养基为：10g/L酵母粉，20g/L蛋白胨，20g/L葡萄糖。在本专利技术的一种实施方式中，所述发酵培养基为：10g/L玉米浆，50g/L大豆蛋白胨，100g/L葡萄糖，2.5g/LK2HPO4，1.5g/LKH2PO4，0.75g/LMgSO4·7H2O。在本专利技术的一种实施方式中，发酵培养条件为，在30℃，转速220rpm。本专利技术还提供了上述酿本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一株酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，其特征在于，所述酿酒酵母保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2021258，保藏日期为2021年3月19日。/n

【技术特征摘要】
1.一株酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，其特征在于，所述酿酒酵母保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M2021258，保藏日期为2021年3月19日。


2.含有权利要求1所述的酿酒酵母的微生物菌剂。


3.权利要求1所述的酿酒酵母在制备有机酸中的应用。


4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述有机酸包括丙酸、丙酮酸、乳酸、苹果酸、富马酸、琥珀酸酸、丁酸、衣康酸、α-酮戊二酸、戊二酸、木糖醛酸、柠檬酸酸、粘康酸、葡萄糖酸和己二酸。


5.一种基因工程菌，其特征在于，以权利要求1所述的酿酒酵母为宿主细胞，过表达了来源于酿酒酵母的MDH3酶和PYC2酶，同时表达了来源于粟酒裂殖酵母
(Schizosaccharom...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘龙，陈坚，吕雪芹，堵国成，李江华，刘延峰，孙利，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32