一种以腺病毒为载体的冠状病毒疫苗及其制备方法技术

本发明专利技术涉及以腺病毒为载体的冠状病毒疫苗的目的氨基酸序列、目的基因序列、包含所述目的基因序列的腺病毒载体、外源转入所述腺病毒载体的细胞以及以包含所述目的氨基酸序列的冠状病毒疫苗。本发明专利技术提供了5种冠状病毒疫苗的目标氨基酸以及相应的基因序列，进一步使用腺病毒为载体，以整合腺病毒E1基因的细胞为包装细胞系，经包装获得重组腺病毒载体冠状病毒疫苗。本发明专利技术提供的冠状病毒疫苗可以快速制备，适用于新型冠状病毒2019‑nCoV的预防，具有良好的免疫原性，可以诱导高水平的抗体表达。

【技术实现步骤摘要】
一种以腺病毒为载体的冠状病毒疫苗及其制备方法
本专利技术涉及流行病预防及疫苗生产领域，具体涉及一种以腺病毒为载体的冠状病毒疫苗及其制备方法。
技术介绍
新型冠状病毒2019-nCoV(WHO命名)是一种以前尚未在人类中发现的新型冠状病毒。国际病毒分类委员会于2020年2月将新型冠状病毒(2019-nCoV)的正式分类名确定为严重急性呼吸综合征冠状病毒2，英文缩写SARS-CoV-2(severeacuterespiratorysyndromecoronavirus2)。WHO于2020年2月将由新型冠状病毒2019-nCoV引发的疾病命名为2019冠状病毒病，英文缩写COVID-19(CoronaVirusDisease2019)。冠状病毒属于套氏病毒目，冠状病毒科，冠状病毒属，是一类具有囊膜、基因组为线性单股正链RNA的病毒，是自然界中广泛存在的一大类病毒，引起的疾病患者表现为从普通感冒到严重肺部感染等不同的临床症状，例如中东呼吸综合征(MERS)和严重急性呼吸道综合症(SARS)。2019-nCoV与SARS-CoV同属于冠状病毒β家族。现亟需开发能够有效预防引起新型冠状病毒2019-nCoV感染的疫苗，用于有效防止新型冠状病毒2019-nCoV感染引起的肺炎，甚至是严重呼吸道感染在全世界范围内的蔓延。目前应用于人体的预防病毒感染的疫苗主要包括采用病毒经减毒后制备的减毒活疫苗，如水痘减毒活疫苗、麻疹减毒活疫苗等；以及灭活全病毒颗粒疫苗，如肠道病毒EV71型灭活疫苗、甲型肝炎疫苗等。然而，减毒疫苗要费很长时间使病毒繁殖许多代，然后逐渐减除病毒的大部分活性，难以满足急性传染病的预防需要。灭活疫苗则在免疫病理方面存在许多难以解决的问题，例如有些灭活病毒进入人体会在病毒入侵时加重病情。随着分子生物学技术和遗传操作技术的广泛应用，重组病毒载体疫苗得到了很大的发展。重组病毒载体疫苗的种类有很多，如痘病毒活载体疫苗、腺病毒载体疫苗、反转录病毒载体疫苗、不分节段的单股RNA病毒载体疫苗等。这些病毒载体因病毒基因组的复制特定和病毒生物学特性的不同，而适合于不同动物和人类疾病的预防与治疗。病毒载体疫苗能够克服传统疫苗的一些弊端，有助于区分野毒感染和疫苗接种，从而达到预防、治疗甚至净化传染病的目的。
技术实现思路
冠状病毒2019-nCoV编码的蛋白包括RNA聚合酶蛋白、纤突蛋白、包膜蛋白、膜蛋白和核衣壳蛋白。其中，纤突蛋白(Spike蛋白，下文简称S蛋白)为糖蛋白。该蛋白既是诱导保护性免疫应答的决定因素，又是与宿主细胞血管紧张素转换酶2(angiotensin-convertingenzyme2，ACE2)受体结合的部位。且在小鼠和非洲绿猴中，S蛋白已被证实可诱导血清中和抗体产生，后者具有中和SARS-CoV的作用。另外，S蛋白可诱导CD4+和CD8+T细胞应答。因此，本专利技术选择S蛋白作为靶标进行冠状病毒疫苗的研发。本专利技术的第一目的是提供以腺病毒为载体的冠状病毒疫苗的目的氨基酸序列，包括含有SEQ1、SEQ2、SEQ3、SEQ4和SEQ5中的一个或多个氨基酸序列，或与其相似度为90％以上的氨基酸序列。所述氨基酸序列参见本专利技术的序列表。本专利技术的第二目的是提供所述冠状病毒疫苗的目的基因序列，其包括编码SEQ1、SEQ2、SEQ3、SEQ4和SEQ5中的一个或多个氨基酸序列或与其相似度为90％以上的氨基酸序列的DNA序列。作为本专利技术的一种优选方案，所述目的基因序列是经过密码子优化后的DNA序列。本专利技术的第三目的是提供包含所述冠状病毒疫苗目的基因序列的腺病毒载体。其是将所述目的基因序列插入到腺病毒载体中构建而成。作为本专利技术的一种优选方案，所述腺病毒载体包括：包含所述目的基因序列的腺病毒穿梭质粒以及腺病毒骨架质粒。所述包含所述目的基因序列的腺病毒穿梭质粒是将所述目的基因序列插入到所述穿梭质粒中构建而成。作为本专利技术的一种优选方案，所述腺病毒载体为AdMax腺病毒系统，其包括：插入所述目的基因序列的AdMax腺病毒系统穿梭质粒(优选含有loxP位点)，还包括AdMax腺病毒系统骨架质粒。本专利技术的第四目的是提供表达所述冠状病毒疫苗目的氨基酸序列的细胞，所述细胞中外源转入了包含所述冠状病毒疫苗目的基因序列的腺病毒载体。作为本专利技术的一种优选方案，所述细胞中外源转入了包含所述冠状病毒疫苗目的基因序列的腺病毒穿梭质粒以及腺病毒骨架质粒。作为本专利技术的一种优选方案，所述细胞中外源转入了包含所述冠状病毒疫苗目的基因序列的AdMax腺病毒系统穿梭质粒以及AdMax腺病毒系统骨架质粒。作为本专利技术的一种优选方案，所述细胞为整合腺病毒E1基因的细胞，优选为HEK-293细胞或HEK-293A细胞。HEK-293细胞是用5型腺病毒75株系转化、含有Ad5E1区的人胚肾亚三倍体细胞系，是一种E1区缺陷互补细胞系。HEK-293细胞是贴壁依赖性呈上皮样细胞，表现出典型的腺病毒转化细胞的表型，其允许Ad5和其它血清型腺病毒在其上增殖。哺乳细胞大规模培养采用的贴壁培养、微载体培养、无血清悬浮培养方式均可用于HEK-293细胞的大规模培养。本专利技术提供的载体优选采用AdMax腺病毒系统，并优选将其转入HEK-293细胞中。AdMax系统包括含有loxP位点的穿梭质粒以及骨架质粒，外源基因序列被构建入穿梭质粒后，通过与骨架质粒在HEK-293细胞中进行基因重组来产生重组腺病毒。其进行重组腺病毒包装的基本原理是通过Cre-loxP或FLP-frt重组酶，使转染进HEK-293细胞的穿梭质粒和骨架质粒发生定点重组，产生重组腺病毒，这样得到的重组病毒是E1缺失的复制缺陷型腺病毒，病毒在不能够提供E1区的细胞中只能实现外源基因的表达而本身不具备增殖能力。AdMax系统的特点是通过重组酶在真核细胞内完成重组出毒，高效且稳定，是目前最方便快捷的腺病毒包装系统之一。与现在使用最普及的AdEasy系统相比，AdMax系统出毒更快，能够高效率、简便而快速地获得重组腺病毒，并且病毒的产率明显提高。利用AdMax系统，只需要2～4周就能完成从质粒构建到重组出毒的全过程，成功率大于98％(其中95％的克隆含有目的基因)，因为重组出毒是在真核细胞内完成的，保持了对腺病毒的生存压力，因此有助于保持重组腺病毒基因组的完整性；而AdEasy系统的出毒成功率只有18-34％，而且在原核细胞(BJ5183)中完成病毒基因组重组，理论上，失去了生存压力的腺病毒基因组更容易发生突变，病毒遗传背景及活性可能会受到影响。本专利技术的第五目的是提供以腺病毒为载体的冠状病毒疫苗，其包含SEQ1、SEQ2、SEQ3、SEQ4和SEQ5中的一个或多个氨基酸序列，或与其相似度为90％以上的氨基酸序列。本专利技术提供的疫苗中还可以含有免疫佐剂。所述免疫佐剂可以选用无机佐剂，优选为氢氧化铝佐剂。所述免疫佐剂还可以选用有机佐剂，如脂多糖、细胞因子等。本专利技术提供的疫苗优选为液体疫苗，可以采用多种剂型形式。具体而言，所述冠状病毒疫苗可以是本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.以腺病毒为载体的冠状病毒疫苗的目的氨基酸序列，其特征在于，包括SEQ1、SEQ2、SEQ3、SEQ4和SEQ5中的一个或多个氨基酸序列，或与其相似度为90％以上的氨基酸序列。/n

【技术特征摘要】
20200212 CN 20201008926061.以腺病毒为载体的冠状病毒疫苗的目的氨基酸序列，其特征在于，包括SEQ1、SEQ2、SEQ3、SEQ4和SEQ5中的一个或多个氨基酸序列，或与其相似度为90％以上的氨基酸序列。


2.以腺病毒为载体的冠状病毒疫苗的目的基因序列，其特征在于，包括编码SEQ1、SEQ2、SEQ3、SEQ4和SEQ5中的一个或多个氨基酸序列或与其相似度为90％以上的氨基酸序列的DNA序列。


3.根据权利要求2所述的目的基因序列，其特征在于，所述目的基因序列是经过密码子优化后的DNA序列。


4.包含权利要求2或3所述目的基因序列的腺病毒载体。


5.根据权利要求4所述的腺病毒载体，其特征在于，所述腺病毒载体包括：包含所述目的基因序列的腺病毒穿梭质粒以及腺病毒骨架质粒。


6.根据权利要求4所述的腺病毒载体，其特征在于，所述腺病毒载体包括：包含所述目的基因序列的AdMax腺病毒系统穿梭质粒以及AdMax腺病毒系统骨架质粒。


7.表达权利要求1所述氨基酸序列的细胞，所述细胞中外源转入了权利要求4～6任意一项所述腺病毒载体。


8.根据权利要求7所述的细胞，其特征在于，所述细胞为整合腺病毒E1基因的细胞，优选为HEK-293细胞或HEK-293A细胞。


9.以腺病毒为载体的冠状病毒疫苗，其包含SEQ1、SEQ2、SEQ3、SEQ4和SEQ5中的一个或多个氨基酸序列，或与其相似度为90％以上的氨基酸序列。


10.根据权利要求9所述的冠状病毒疫苗，其特征在于，所述疫苗中还含有免疫佐剂。


11.根据权利要求10所述的冠状病毒疫苗，其特征在于，所述免疫佐剂为...

【专利技术属性】
技术研发人员：高强，郑泽宇，吴慕胜，王治伟，吕哲，
申请(专利权)人：北京科兴中维生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11