检测原料乳中产耐热蛋白酶荧光假单胞菌的LAMP引物组及其应用制造技术

本发明专利技术属于荧光假单胞菌的检测技术领域。针对现有LAMP检测技术存在的反应时间较长的问题，本发明专利技术提供一种检测原料乳中荧光假单胞菌的LAMP引物组及应用。LAMP引物组的组成：外引物组GTACCTGACCAACAACAGCT；GCTCTCGCTCCAGTAGCT；内引物组：AGGGTATGGCCGATTTCGTGGGGAACAAGACCCCGGACCT；GCTCACCCTGGCG ACTACAACGTGTAGCCGCGCGTGTC；环引物组：TGCCGGCCGTAGTTGTTC；GGCAA CCCGACCTACAACG。本发明专利技术将LAMP反应时间缩短至原有的一半，检测效率明显提高。

【技术实现步骤摘要】
检测原料乳中产耐热蛋白酶荧光假单胞菌的LAMP引物组及其应用
本专利技术属于荧光假单胞菌的检测
，具体涉及检测原料乳中产耐热蛋白酶荧光假单胞菌的LAMP引物组及应用。
技术介绍
乳制品含有人体所需的各类营养物质且易被消化吸收，近年来越发受到广大消费者的青睐。原料乳作为各类乳制品的主要原料，其质量优劣直接影响到乳制品的品质。荧光假单胞菌是一类能够在0～7℃条件下生长繁殖的微生物，广泛存在于乳品加工生产的各个环节，极易通过与原料乳的接触而导致污染。乳品工业中低温冷链技术的运用，使具有嗜冷特性的荧光假单胞菌在原料乳菌群结构中占据优势，成为导致原料乳品质降低的主要腐败菌。此外，其分泌的部分胞外酶，可以经受住巴氏杀菌和超高温灭菌处理过程中的温度，而仍保持一定催化活性，残余酶活作用于乳品中的蛋白质和脂肪，导致陈化凝胶、蛋白水解、脂肪上浮及苦味产生。荧光假单胞菌及其耐热酶对乳品的危害已得到广泛研究，被认为是制约乳品工业发展的主要因素之一。因而，原料乳中荧光假单胞菌数量的监测成为控制乳品安全的关键。国际标准中嗜冷菌的测定方法是将原料乳样品稀释液，接种到琼脂培养基，在6.5℃下培养10d(IDFStandard101A)或于21℃培养25h(IDFStandard132A)后计数。前者实验周期长，后者结果准确性较差。两种方法均不能满足现场实时检测的要求。分子生物学方法如PCR技术发展迅速,是一种快速、高效的检测方法,而PCR和荧光定量PCR都需要通过繁琐的变温程序进行检测,且PCR后续需要电泳才能观察结果。环介导等温扩增(1oopmediatedisothermalamplification,LAMP)目的基因的6个特定区域设计至少4条特异性引物，利用链置换DNA聚合酶(BstDNApolymerase)在65℃左右条件下恒温孵育几十分钟，即可完成扩增反应。具有操作简单、灵敏度高、等温快速的优点。在DNA不断延伸合成的同时，脱氧核酸三磷酸基质(dNTPs)析出的焦磷酸离子与反应溶液中的Mg2+结合，产生大量焦磷酸镁衍生物，该衍生物可以与核酸染料SYBRGreenI反应，呈现不同颜色，肉眼即可判定检测结果。目前的LAMP扩增体系在反应时间上一般在60min左右，反应时间有待于进一步缩短。
技术实现思路
针对现有原料乳中产耐热蛋白酶荧光假单胞菌的LAMP检测技术存在的反应时间较长的上述问题，本专利技术提供一种检测原料乳中产耐热蛋白酶荧光假单胞菌的LAMP引物组及应用，与现有的LAMP引物组不同，LAMP反应体系的反应时间能够缩短至原反应时间的约一半。本专利技术是通过以下技术方案实现的：本专利技术一方面提供检测原料乳中产耐热蛋白酶荧光假单胞菌的LAMP引物组，由下列引物组成：上游外引物F3:5’-GTACCTGACCAACAACAGCT-3’；下游外引物B3:5’-GCTCTCGCTCCAGTAGCT-3’；上游内引物FIP：5’-AGGGTATGGCCGATTTCGTGGGGAACAAGACCCCGGACCT-3’；下游内引物BIP：5’-GCTCACCCTGGCGACTACAACGTGTAGCCGCGCGTGTC-3’；上游环引物LF：5’-TGCCGGCCGTAGTTGTTC-3’；下游环引物LB：5’-GGCAACCCGACCTACAACG-3’。本专利技术还提供一种用于检测原料乳中产耐热蛋白酶荧光假单胞菌的试剂盒，包括上述LAMP引物组。进一步的，所述的试剂盒还包括ThermoPol反应缓冲液、BstDNA聚合酶、dNTPs及灭菌ddH2O。本专利技术还提供一种检测原料乳中产耐热蛋白酶荧光假单胞菌的方法：将源自原料乳中的荧光假单胞菌接种至LB培养基中培养，当荧光假单胞菌浓度为2.57×102CFU/mL以上时提取DNA，以提取的DNA为作为LAMP扩增体系中的模板；利用上述LAMP引物组进行LAMP扩增扩增，向扩增体系中加入SYBRGreenI染料，当样品提取模板含荧光假单胞菌时，显色呈绿色；样品提取模板非荧光假单胞菌时，显色呈橙色。进一步的，LAMP扩增体系为：10×ThermoPol反应缓冲液，2.5μL；外引物F3/B3，10μM，0.5μL；内引物FIP/BIP，10μM，2μL；环引物LpF/LpB，10μM，1μL；模板1μL；BstDNA聚合酶8U/μL，0.6μL；dNTPs，10mM，0.8mmol/L；Mg2+，100mM，6.0mmol/L；灭菌ddH2O，10.9μL。进一步的，LAMP扩增体系的反应条件：63℃孵育30min。本专利技术的有益效果：本专利技术的LAMP引物组不同于现有的引物组，能够大大缩短反应时间，提高检测效率，同时结果准确可靠、操作简便、检测成本低，适用于食品样品的检测。附图说明图1为采用LAMP引物组检测4株荧光假单胞菌的显色反应及其电泳结果，图中反应管1～5号分别为阴性对照、CICC23250、CICC23251、CICC23253、PF；电泳图1～5号分别为阴性对照、CICC23250、CICC23251、CICC23253、PF。图2为采用LAMP引物组检测其他6株常见污染菌的显色反应及其电泳结果，图中反应管1～6号中分别为铜绿假单胞菌、恶臭假单胞菌、单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌，7号为阳性对照；电泳图1～8号泳道分别为阴性对照、铜绿假单胞菌、恶臭假单胞菌、单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌、阳性对照(CICC23250)。图3为LAMP检测不同浓度产耐热蛋白酶荧光假单胞菌(以CICC23250为例)的琼脂糖凝胶电泳结果。图中1号泳道为阴性对照，2～8号泳道荧光假单胞菌DNA模板浓度分别为2.57×107～2.57×101CFU/mL。具体实施方式下面结合具体实施例及附图对本专利技术做进一步详细说明。实施例1：原料乳中产耐热蛋白酶荧光假单胞菌的特异性检测(1)生物信息学分析获得荧光假单胞菌的蛋白酶基因aprX序列中的保守区域。将保守区域的序列输入到LAMP引物设计软件PrimerexplorerV5中，设计得到以下引物序列(引物由上海生工生物工程有限公司合成)：F3:5’-GTACCTGACCAACAACAGCT-3’,(SEQIDNO:1)B3:5’-GCTCTCGCTCCAGTAGCT-3’，(SEQIDNO:2)FIP:5’-GGGTATGGCCGATTTCGTGGGGAACAAGACCCCGGACCT-3’，(SEQIDNO:3)；BIP:5’-GCTCACCCTGGCGACTACAACGTGTAGCCGCGCGTGTC-3’，(SEQIDNO:4)LF：5’-TGCCGGCCGTAGTTGTTC-3’，(SEQIDNO:5)LB：5’-GGCAACCCGACCTACAACG-3’，(SEQIDNO:6)本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.检测原料乳中产耐热蛋白酶荧光假单胞菌的LAMP引物组，其特征在于，由下列引物组成：/n上游外引物F3:5’-GTACCTGACCAACAACAGCT-3’；/n下游外引物B3:5’-GCTCTCGCTCCAGTAGCT-3’；/n上游内引物FIP：/n5’-AGGGTATGGCCGATTTCGTGGGGAACAAGACCCCGGACCT-3’；/n下游内引物BIP：5’-GCTCACCCTGGCGACTACAACGTGTAGCCGCGCGTGTC-3’；/n上游环引物LF：5’-TGCCGGCCGTAGTTGTTC-3’；/n下游环引物LB：5’-GGCAACCCGACCTACAACG-3’。/n

【技术特征摘要】
1.检测原料乳中产耐热蛋白酶荧光假单胞菌的LAMP引物组，其特征在于，由下列引物组成：
上游外引物F3:5’-GTACCTGACCAACAACAGCT-3’；
下游外引物B3:5’-GCTCTCGCTCCAGTAGCT-3’；
上游内引物FIP：
5’-AGGGTATGGCCGATTTCGTGGGGAACAAGACCCCGGACCT-3’；
下游内引物BIP：5’-GCTCACCCTGGCGACTACAACGTGTAGCCGCGCGTGTC-3’；
上游环引物LF：5’-TGCCGGCCGTAGTTGTTC-3’；
下游环引物LB：5’-GGCAACCCGACCTACAACG-3’。


2.一种用于检测原料乳中产耐热蛋白酶荧光假单胞菌的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的LAMP引物组。


3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，还包括ThermoPol反应缓冲液、BstDNA聚合酶、dNTPs及灭菌ddH2O。


4.一...

【专利技术属性】
技术研发人员：易华西，乔文君，刘同杰，公丕民，张兰威，艾连中，王世杰，章检明，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：山东;37