基于单碱基突变的氟喹诺酮类抗生素抗性的快速检测方法及其应用技术

本发明专利技术提出基于单碱基突变的氟喹诺酮类抗生素抗性的快速检测方法及其应用，通过对氟喹诺酮类抗生素靶标基因gyrA基因设计全长扩增引物，获得最佳特异性引物的上游引物核苷酸序列为SEQ ID NO.1，下游引物核苷酸序列为SEQ ID NO.2，该引物对可通过常规PCR获得待检测细菌的氟喹诺酮类抗生素靶标基因gyrA全长，然后再与氟喹诺酮类抗生素敏感菌的gyrA基因序列比对，判断是否有碱基突变，该方法操作步骤简单易行，该引物对扩增得到的基因片段特异性好，结果准确。

【技术实现步骤摘要】
基于单碱基突变的氟喹诺酮类抗生素抗性的快速检测方法及其应用
本专利技术涉及环境和生物检测
，特别涉及基于单碱基突变的氟喹诺酮类抗生素抗性的快速检测方法及其应用。
技术介绍
近年来，规模化畜禽养殖业的快速发展导致抗生素的使用量日益增加，抗生素常用于畜禽养殖中动物疾病的预防和治疗以及促进畜禽生长等目的，然而由于一些抗生素在动物体内吸收或者代谢不完全，最终以母体化合物或者代谢产物的形式通过尿液和粪便排出，导致环境中抗生素含量不断增加，而某些抗生素如氟喹诺酮类抗生素在环境中可稳定持留数月。有研究报道痕量抗生素足以对细菌形成选择压力，最终导致细菌耐药性的形成，对公共卫生安全构成严重威胁。因此，准确快速地检测环境中常见的病原微生物是否具有抗生素抗性十分有必要。氟喹诺酮类抗生素为化学合成广谱抗菌药，氟喹诺酮类抗生素主要是通过与细菌DNA复制相关的DNA旋转酶A亚基(gyraseA，gyrA)特异性结合，抑制DNA旋转酶的活性，干扰细菌DNA形成超螺旋，阻碍DNA的正常功能从而发挥杀菌作用。目前细菌产生氟喹诺酮类抗生素抗性的主要分子机制有以下几种：一种是质粒介导的抗性基因，如qnr家族基因和qepA基因，此类基因可通过荧光定量PCR技术进行快速检测；另一种是减少胞内氟喹诺酮类抗生素的积累，此项分子机制涉及到的相关基因众多，不具有特异性；最后是靶标基因DNA旋转酶A亚基的单碱基突变，导致DNA旋转酶A亚基的氨基酸编码发生错义突变，相应的蛋白构型发生改变，使其与氟喹诺酮类抗生素的结合能力变弱，进而产生氟喹诺酮类抗生素抗性。而基于单碱基突变机制的研究主要通过全基因组测序进行探究，存在实验检测周期较长且耗费较大等不足。
技术实现思路
本专利技术的主要目的是提供一种扩增氟喹诺酮类抗生素靶标基因的引物对，旨在特异性获得细菌的gyrA基因全长序列，并对其碱基突变位点进行分析，有助于快速判断菌株是否带有氟喹诺酮类抗生素抗性。为实现上述目的，本专利技术提出一种扩增氟喹诺酮类抗生素靶标基因的引物对，包括：上游引物，所述上游引物的核苷酸序列为SEQIDNO.1；下游引物，所述下游引物的核苷酸序列为SEQIDNO.2。本专利技术还提出一种扩增氟喹诺酮类抗生素靶标基因的引物对，上游引物的核苷酸序列包括与SEQIDNO.1差别为任意一个碱基的核苷酸序列；下游引物的核苷酸序列为SEQIDNO.2。本专利技术还提出一种扩增氟喹诺酮类抗生素靶标基因的引物对，上游引物的核苷酸序列为SEQIDNO.1；下游引物的核苷酸序列包括与SEQIDNO.2差别为任意一个碱基的核苷酸序列。本专利技术还提出一种扩增氟喹诺酮类抗生素靶标基因的引物对，上游引物的核苷酸序列包括与SEQIDNO.1差别为任意一个碱基的核苷酸序列；下游引物的核苷酸序列包括与SEQIDNO.2差别为任意一个碱基的核苷酸序列。本专利技术还提出一种扩增氟喹诺酮类抗生素靶标基因的试剂盒，包括上述任意一项所述的一种扩增氟喹诺酮类抗生素靶标基因的引物对。可选地，所述试剂盒还包括DNA聚合酶和扩增缓冲液。本专利技术还提出一种基于靶标基因单碱基突变的氟喹诺酮类抗生素抗性的快速检测方法，包括：使用上述任意一项所述的一种扩增氟喹诺酮类抗生素靶标基因的引物对，或使用上述的一种扩增氟喹诺酮类抗生素靶标基因的试剂盒对待检测细菌的基因组进行PCR扩增得到目的条带；将所述目的条带进行测序，并与氟喹诺酮类抗生素敏感菌的靶标基因序列进行比对，判断是否有突变碱基；若有突变碱基，则待检测细菌为氟喹诺酮类抗生素抗性菌；若没有突变碱基，则待检测细菌为氟喹诺酮类抗生素敏感菌。本专利技术技术方案通过对氟喹诺酮类抗生素靶标基因gyrA基因设计全长扩增引物，获得最佳特异性引物的上游引物核苷酸序列为SEQIDNO.1，下游引物核苷酸序列为SEQIDNO.2，该引物对可通过常规PCR获得待检测细菌的氟喹诺酮类抗生素靶标基因gyrA全长，然后再与氟喹诺酮类抗生素敏感菌的gyrA基因序列比对，判断是否有碱基突变，该方法操作步骤简单易行，该引物对扩增得到的基因片段特异性好，结果准确。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。图1为本专利技术的扩增氟喹诺酮类抗生素靶标基因的引物对扩增敏感型菌株的靶标基因产物电泳结果图；图2为敏感型菌株的靶标基因序列与模式菌株的靶标基因序列比对结果；图3为本专利技术的扩增氟喹诺酮类抗生素靶标基因的引物对扩增敏感型菌株和突变菌株的靶标基因产物电泳结果图；图4为敏感型菌株和突变菌株的靶标基因序列与模式菌株的靶标基因序列比对结果；图5为恩诺沙星和环丙沙星对敏感型菌株和突变菌株的最小抑制浓度实验结果图。本专利技术目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。本专利技术提出一种扩增氟喹诺酮类抗生素靶标基因的引物对，包括：上游引物，所述上游引物的核苷酸序列为SEQIDNO.1；下游引物，所述下游引物的核苷酸序列为SEQIDNO.2。氟喹诺酮类抗生素通过与细菌DNA复制相关的DNA旋转酶A亚基(gyraseA，gyrA)特异性结合，抑制DNA旋转酶的活性，干扰细菌DNA形成超螺旋，阻碍DNA的正常功能从而发挥杀菌作用。靶标基因DNA旋转酶A亚基的单碱基突变，导致DNA旋转酶A亚基的氨基酸编码发生错义突变，相应的蛋白构型发生改变，使其与氟喹诺酮类抗生素的结合能力变弱，进而产生氟喹诺酮类抗生素抗性。gyrA基因的全长序列如SEQIDNO.3所示，基于gyrA基因的全长序列设计扩增引物，得到上游引物核苷酸序列为SEQIDNO.1(gyrA-F：5’-ATGAGCGACCTTGCGAGA-3’)，下游引物核苷酸序列为SEQIDNO.2(gyrA-R：5’-TTATTCTTCTTCTGGCTCGTCG-3’)。该引物对可以扩增得到gyrA基因全长序列，通过将待检测细菌的gyrA基因全长序列与氟喹诺酮类抗生素敏感菌的gyrA基因全长序列进行比对，就可以发现待检测细菌的gyrA基因全长序列是否有突变，从而判断待检测细菌是否为氟喹诺酮类抗生素抗性菌。本专利技术技术方案通过对氟喹诺酮类抗生素靶标基因gyrA基因设计全长扩增引物，获得最佳特异性引物的上游引物核苷酸序列为SEQIDNO.1，下游引物核苷酸序列为SEQIDNO本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种扩增氟喹诺酮类抗生素靶标基因的引物对，其特征在于，包括：/n上游引物，所述上游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.1；/n下游引物，所述下游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.2。/n

【技术特征摘要】
1.一种扩增氟喹诺酮类抗生素靶标基因的引物对，其特征在于，包括：
上游引物，所述上游引物的核苷酸序列为SEQIDNO.1；
下游引物，所述下游引物的核苷酸序列为SEQIDNO.2。


2.一种扩增氟喹诺酮类抗生素靶标基因的引物对，其特征在于，上游引物的核苷酸序列包括与SEQIDNO.1差别为任意一个碱基的核苷酸序列；
下游引物的核苷酸序列为SEQIDNO.2。


3.一种扩增氟喹诺酮类抗生素靶标基因的引物对，其特征在于，上游引物的核苷酸序列为SEQIDNO.1；
所述引物的核苷酸序列包括与SEQIDNO.2差别为任意一个碱基的核苷酸序列。


4.一种扩增氟喹诺酮类抗生素靶标基因的引物对，其特征在于，上游引物的核苷酸序列包括与SEQIDNO.1差别为任意一个碱基的核苷酸序列；
下游引物的核苷酸序列包括与SEQIDNO.2差别为任意一个碱...

【专利技术属性】
技术研发人员：李炳，梁贺彬，张家禹，雷华新，
申请(专利权)人：清华大学深圳国际研究生院，
类型：发明
国别省市：广东;44