一种细胞角蛋白18基因表达检测试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及一种细胞角蛋白18基因表达检测试剂盒及其检测方法，其包括针对CK18基因mRNA的捕获探针以及信号放大系统；所述捕获探针为茎环状γPNA‑PNA探针，其从5’端到3’端的组成依次为：茎部结构序列、P1序列、Linker、P2序列；所述信号放大系统包括标记探针SP1和标记探针SP2；每条标记探针SP1从5’端到3’端的组成依次为：P3序列、间隔臂序列、P4序列，且P3序列5’端修饰有荧光基团；每条标记探针SP2从5’端到3’端的组成依次为：P5序列、间隔臂序列、P6序列，且P6序列3’端修饰有荧光基团。该试剂盒具有灵敏度高、特异性强、准确率高、检测时间短等优点。

【技术实现步骤摘要】
一种细胞角蛋白18基因表达检测试剂盒
本专利技术涉及分子生物学领域，特别是涉及一种细胞角蛋白18基因表达检测试剂盒。
技术介绍
细胞角蛋白18(CK18)是一种Ⅰ型酸性中间丝蛋白，属于细胞骨架蛋白家族，其基因定位于人类染色体12q13.13，含8个外显子。CK18主要在单层或“简单”上皮组织中表达，如肝、肺、肾、胰腺、胃肠道、乳腺等，也在这些组织产生的癌症中表达(WengYRetal.,MolCancerRes,2012,10:485–493)。CK18的已知生物学功能是提供一个灵活的细胞内支架来构建细胞质，抵抗外界施加在细胞上的压力，并维持正常的线粒体结构(WengYRetal.,MolCancerRes,10:485–493)。CK18还在细胞凋亡、有丝分裂、细胞周期进程和细胞信号传导等过程中发挥着重要作用。此外，CK18多年来一直被认为是诊断组织病理学的上皮标志物，并且在肿瘤细胞行为中具有重要的功能。研究表明，CK18表达是多种肿瘤潜在的预后标志物(WengYRetal.,MolCancerRes,2012,10:485–493)。例如，在乳腺癌和结直肠癌中，CK18表达降低与肿瘤进展有关(WoelfeUetal.,ClinCancerRes,2004,10:2670–2674；KnoselTetal.,CellOncol,2006,28:167–175)；在食管鳞状细胞癌、恶性黑色素瘤、胃癌和非小细胞肺癌中，CK18表达水平升高与肿瘤不良预后相关(MakinoTetal.,BrJCancer,2009,10:1298–1306；ChenNetal.,MelanomaResearch,2009,19:87；SaadAAetal.,AnnSurgOncol,2010,17:3059–3067；ZhangBetal.,JCancerResClinOncol,2016,142:2479–2487)。一项针对11952例肿瘤的组织芯片研究显示，源自CK18阳性组织的癌症中CK18表达下调或缺失以及源自CK18阴性组织的癌症中CK18新表达与癌症进展有关，并可能影响肿瘤的去分化(MenzAetal.,MolMed,2021,27:16)。可见，CK18的功能失调可能在不同癌症的发病机制中起重要作用。另外，在循环肿瘤细胞(CTCs)研究中，CK18被作为上皮型标志物，用于CTCs的分离与鉴定(WuSetal.,PLoSONE2015,10:e0123976)。鉴于CK18表达与肿瘤的密切关系，促使我们开发一种CK18基因表达检测试剂盒，该试剂盒将有助于深入研究CK18基因在不同癌症的发病机制中的确切作用及其在肿瘤诊断、预后和治疗方面的临床意义，并将为肿瘤诊断、预后和治疗提供有用的临床辅助信息。目前CK18表达检测多采用免疫组化和实时定量PCR。免疫组化是在蛋白水平上检测CK18表达；但是，该方法的局限性在于：检测所需组织样本取材受限，检测结果的准确性受抗体的种类、抗原修复方法、染色方法和条件等诸多因素的影响，结果判读的主观性强。实时定量PCR主要是用于检测组织/细胞样本中CK18基因表达水平，具有灵敏度高、序列特异性强等优点；但是，该方法对实验条件要求很高，必须严格避免污染，否则难以保证检测结果的准确性和可靠性。针对上述问题，中国专利CN201410228511.9提供了一种检测基因表达的RNA原位杂交方法，所述方法的检测探针可实现RNA原位检测的荧光信号放大，提高检测的灵敏度，但是进一步的研究发现，上述RNA原位杂交检测方法中捕获探针的杂交选择性以及信号放大系统需要进一步优化，以达到更好的检测效果。
技术实现思路
基于此，本专利技术的目的是提供一种具有更高杂交亲和力、更好杂交选择性以及更好杂交稳定性的细胞角蛋白18基因表达检测试剂盒。具体技术方案如下：一种CK18基因表达检测试剂盒，包括针对检测CK18基因mRNA的捕获探针以及信号放大系统；所述信号放大系统包括标记探针SP1和标记探针SP2；其中，所述捕获探针为茎环状γPNA-PNA探针，其从5’端到3’端的组成依次为：茎部结构序列、P1序列、Linker、P2序列；所述茎部序列为可与P2序列3’端的碱基互补形成茎环结构的γPNA序列；所述特异性P1序列为能与CK18基因mRNA特异性结合的γPNA序列；所述linker为EG8Linker；所述P2序列为与P1和CK18基因mRNA之间均不存在特异性结合的PNA序列；所述标记探针SP1连接捕获探针与标记探针SP2，其从5’端到3’端的组成依次为：P3序列、间隔臂序列、P4序列；所述P3序列能与捕获探针的P2序列互补配对并修饰有荧光基团；所述P4序列为与P1、P2、P3和CK18基因mRNA之间均不存在特异性结合的核酸序列；所述标记探针SP2用于连接标记探针SP1，其从5’到3’端的碱基组成依次为：P5序列、间隔臂序列、P6序列；所述P5序列为能与标记探针SP1的P4序列互补配对的核酸序列；所述P6与标记探针SP1的P3序列互补配对，与捕获探针的P2序列碱基组成相同，并修饰有与对应标记探针SP1一致的荧光基团。在其中一些实施例中，上述针对CK18基因mRNA的捕获探针中，特异性P1序列选自SEQIDNO.1～SEQIDNO.10以及SEQIDNO.1～SEQIDNO.10的完全互补序列中的任意至少3条，茎部结构序列为SEQIDNO.21或其互补序列，P2序列为SEQIDNO.23或其互补序列；和/或，上述针对CK18基因mRNA的标记探针SP1中，P3序列为SEQIDNO.25或其互补序列，P4序列为SEQIDNO.27或其互补序列；和/或，上述针对CK18基因mRNA的标记探针SP2中，P5序列为SEQIDNO.29或其互补序列，P6序列为SEQIDNO.23或其互补序列。在其中一些实施例中，上述试剂盒还包括针对内参基因mRNA的捕获探针以及信号放大系统；上述针对内参基因mRNA的捕获探针以及信号放大系统与针对CK18基因mRNA的捕获探针以及信号放大系统的结构相同，但标记探针修饰的荧光基团不同。在其中一些实施例中，上述内参基因为ACTB。在其中一些实施例中，上述CK18基因表达检测试剂盒，其针对ACTB基因mRNA的捕获探针中，特异性P1序列选自SEQIDNO.11～SEQIDNO.20以及SEQIDNO.11～SEQIDNO.20的完全互补序列中的任意至少3条，茎部结构序列为SEQIDNO.22或其互补序列，P2序列为SEQIDNO.24或其互补序列；针对ACTB基因mRNA的标记探针SP1中，P3序列为SEQIDNO.26或其互补序列，P4序列为SEQIDNO.28或其互补序列；针对ACTB基因mRNA的标记探针SP2中，P5序列为SEQIDNO.30或其互补序列，P6序列为SEQIDNO.24或其互补序列。在其中一些实施例中，上述捕获探针中的茎部序列长度为4～8bp，特异性P1序列长度为10～22bp。在本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种CK18基因表达检测试剂盒，其特征在于，包括针对检测CK18基因mRNA的捕获探针以及信号放大系统；所述信号放大系统包括标记探针SP1和标记探针SP2；其中，/n所述捕获探针为茎环状γPNA-PNA探针，其从5’端到3’端的组成依次为：茎部结构序列、P1序列、Linker、P2序列；所述茎部序列为可与P2序列3’端的碱基互补形成茎环结构的γPNA序列；所述特异性P1序列为能与CK18基因mRNA特异性结合的γPNA序列；所述linker为EG8 Linker；所述P2序列为与P1和CK18基因mRNA之间均不存在特异性结合的PNA序列；/n所述标记探针SP1连接捕获探针与标记探针SP2，其从5’端到3’端的组成依次为：P3序列、间隔臂序列、P4序列；所述P3序列能与捕获探针的P2序列互补配对并修饰有荧光基团；所述P4序列为与P1、P2、P3和CK18基因mRNA之间均不存在特异性结合的核酸序列；/n所述标记探针SP2用于连接标记探针SP1，其从5’到3’端的碱基组成依次为：P5序列、间隔臂序列、P6序列；所述P5序列为能与标记探针SP1的P4序列互补配对的核酸序列；所述P6与标记探针SP1的P3序列互补配对，与捕获探针的P2序列碱基组成相同，并修饰有与对应标记探针SP1一致的荧光基团。/n...

【技术特征摘要】
1.一种CK18基因表达检测试剂盒，其特征在于，包括针对检测CK18基因mRNA的捕获探针以及信号放大系统；所述信号放大系统包括标记探针SP1和标记探针SP2；其中，
所述捕获探针为茎环状γPNA-PNA探针，其从5’端到3’端的组成依次为：茎部结构序列、P1序列、Linker、P2序列；所述茎部序列为可与P2序列3’端的碱基互补形成茎环结构的γPNA序列；所述特异性P1序列为能与CK18基因mRNA特异性结合的γPNA序列；所述linker为EG8Linker；所述P2序列为与P1和CK18基因mRNA之间均不存在特异性结合的PNA序列；
所述标记探针SP1连接捕获探针与标记探针SP2，其从5’端到3’端的组成依次为：P3序列、间隔臂序列、P4序列；所述P3序列能与捕获探针的P2序列互补配对并修饰有荧光基团；所述P4序列为与P1、P2、P3和CK18基因mRNA之间均不存在特异性结合的核酸序列；
所述标记探针SP2用于连接标记探针SP1，其从5’到3’端的碱基组成依次为：P5序列、间隔臂序列、P6序列；所述P5序列为能与标记探针SP1的P4序列互补配对的核酸序列；所述P6与标记探针SP1的P3序列互补配对，与捕获探针的P2序列碱基组成相同，并修饰有与对应标记探针SP1一致的荧光基团。


2.根据权利要求1所述的CK18基因表达检测试剂盒，其特征在于，针对CK18基因mRNA的捕获探针中，特异性P1序列选自SEQIDNO.1～SEQIDNO.10以及SEQIDNO.1～SEQIDNO.10的完全互补序列中的任意至少3条，茎部结构序列为SEQIDNO.21或其互补序列，P2序列为SEQIDNO.23或其互补序列；
和/或，针对CK18基因mRNA的标记探针SP1中，P3序列为SEQIDNO.25或其互补序列，P4序列为SEQIDNO.27或其互补序列；
和/或，针对CK18基因mRNA的标记探针SP2中，P5序列为SEQIDNO.29或其互补序列，P6序列为SEQIDNO.23或其互补序列。


3.根据权利要求1所述CK18基因表达检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括针对内参基因mRNA的捕获探针以...

【专利技术属性】
技术研发人员：许嘉森，吴诗扬，黄洁芬，
申请(专利权)人：益善生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44