基于根瘤菌III型效应因子NopP的农杆菌转化载体及其应用制造技术

本发明专利技术涉及生物工程和基因工程技术领域，具体涉及基于根瘤菌III型效应因子NopP的农杆菌转化载体及其应用。其中所述NopP的编码基因在载体中与启动子可操作连接形成表达元件并插入到T‑DNA序列的多克隆位点。本发明专利技术构建的农杆菌转化载体能够进一步提高日本百脉根的发根转化效率，增加了获取转基因毛状根的概率，而且NopP的表达也没有影响日本百脉根与根瘤菌的正常结瘤共生，极大地提高日本百脉根发根转化的有效性与实用性。

【技术实现步骤摘要】
基于根瘤菌III型效应因子NopP的农杆菌转化载体及其应用
本专利技术涉及生物工程和基因工程
，涉及发根农杆菌的转化，具体涉及基于根瘤菌III型效应因子NopP的农杆菌转化载体及其应用。
技术介绍
日本百脉根(Lotusjaponicus)是发根转化以及植物-微生物互作研究的常用研究工具。其短暂的生活周期，可适用于各种遗传研究。早花品系生态型MG20(Kawaguchi,M.(2000)Lotusjaponicus‘Miyakojima’MG-20anearly-floweringaccessionsuitableforindoorhandling.JPlantRes.113(4):507–509.)尤为适合室内实验。日本百脉根的基因组已测序完成(Li,C,Xue,DandWang,Y,etal.(2020)Amethodforfunctionaltestingconstitutiveandligand-inducedinteractionsoflysinmotifreceptorproteins.PlantMethods.doi:10.1186/s13007-020-0551-4.)。因为其完整的基因组，日本百脉根也已成功运用于多种基因图谱研究中。作为一种典型的模式豆科植物，其常用于各种共生，如结瘤共生的研究中。在此情况下，发根农杆菌介导的发根转化已广泛用于日本百脉根的植物基因转移以研究基因功能。为研究结瘤共生，可利用MG20的转基因根来分析与固氮相关的宿主基因。日本百脉根的转基因根则可以接种诸如MAFF303099的百脉根中慢生根瘤菌(Mesorhizobiumloti)菌株来获取结瘤的毛状根。此外，诱导的转基因毛状根还能用来研究不同病原细菌菌株诱发的效应因子触发性免疫相关的植物防御(Sato,S,Nakamura,YandKaneko,T,etal.(2008)Genomestructureofthelegume,Lotusjaponicus.DNARes.15(4):227-239)。农杆菌(Agrobacterium)介导的植物转化是研究指定基因在植物体内功能的有效方法之一(Luo,Y,Liu,DandJiao,S,etal.(2020)IdentificationofRobiniapseudoacaciatargetproteinsresponsivetoMesorhizobiumamphoreCCNWGS0123effectorproteinNopT.JExpBot.71(22):7347-7363.)。根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)介导的植物细胞转化能研究效应因子在整株植物中的功能。与诱导瘤状物形成的根癌农杆菌类似，发根农杆菌(Agrobacteriumrhizogenes)也常用于不同宿主植物的转化，以诱导转基因毛状根的形成，所获转基因毛状根可广泛运用于各种植物生物技术。转入带有T-DNA的二元载体的农杆菌，能在诱导的宿主植物毛状根中转化与表达特定基因。T-DNA通常含有指定基因的完整表达盒以及用于筛选转基因植物的标记基因。农杆菌介导的发根转化虽已广泛运用于植物转化，但是，受制于植物种类，该技术仍存在局限，并且转化方法也存有提升空间。对大多数植物而言，筛选合适的农杆菌，改造二元载体来提高转化效率尤为必要。而针对日本百脉根MG20的发根转化实验往往呈现出相对较低的转化效率(Kumagai,HandKouchi,H.(2007)GenesilencingbyexpressionofhairpinRNAinLotusjaponicusrootsandrootnodules.MolPlantMicrobeInteract.16(8):663-668；Díaz,CL,MandSchlaman,R,etal.(2005)Inductionofhairyrootsforsymbioticgeneexpressionstudies.InLotusjaponicusHandbook,MárquezAJeditor.Springer.pp.261-277；Estrada-Navarrete,G,Alvarado-Affantranger,XandOlivares,JE,etal.(2006)AgrobacteriumrhizogenestransformationofthePhaseolusspp.:atoolforfunctionalgenomics.MolPlantMicrobeInteract.19(12):1385-1393.)。由于未转化毛状根的比例较高，对实验结果的负面影响极其巨大，当务之急是改善当前日本百脉根的转化方法，利用更为高效的植物转化二元载体以及合适的发根农杆菌菌株来促进日本百脉根的转化效率。作为广宿主菌株的中华根瘤菌(Rhizobiumsp.)NGR234，能分泌多个III型效应因子，已鉴定的III型效应因子包括NopL，NopM，NopP和NopT等。根瘤菌通过将III型效应因子转运到宿主植物体内抑制植物免疫反应以促进其侵染并增加根瘤菌与豆科宿主之间的结瘤共生效率。目前用于日本百脉根转化实验的发根农杆菌菌株包括A.rhizogenesLBA1334，K599和LBA9402。LBA1334被广泛用于日本百脉根的转化(Amin,AN,Hayashi,SandBartlem,DG.(2014)Robustinvitroassaysystemforquantitativeanalysisofparasiticroot-knotnematodeinfestationusingLotusjaponicus.JBiosciBioeng.118(2):205-213.)。本专利技术人研究表明，携带pISV-DsRed1的LBA1334展现出较低的转化效率。而K599是因为其已用于百脉根(Lotuscorniculatus)的转化(Jian,B,Hou,WandWu,C,etal.(2009)Agrobacteriumrhizogenes-mediatedtransformationofSuperroot-derivedLotuscorniculatusplants:avaluabletoolforfunctionalgenomics.BMCPlantBiol.78(9):doi:10.1186/1471-2229-9-78.)。
技术实现思路
本专利技术人研究发现根瘤菌III型效应因子nopP的表达可以极大地促进了发根农杆菌介导的日本百脉根发根转化效率。据此，本专利技术的目的在于提供根瘤菌III型效应因子NopP的编码基因在构建农杆菌转化载体中的应用。其中，农杆菌转化载体是带有T-DNA的农杆菌双元转化载体，优选是发根农杆菌双元转化载体，所述NopP的编码基因在载体中与启动子可操作连接形成表达元件以便能正常表达；更优选地，所述表达元件插入到T-DNA序列的多克隆位点。相应地，本专利技术提供基于根瘤菌III型效应因子NopP的编码基因的农杆菌转化载体，其中本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.根瘤菌III型效应因子NopP的编码基因在构建农杆菌转化载体中的应用。/n

【技术特征摘要】
1.根瘤菌III型效应因子NopP的编码基因在构建农杆菌转化载体中的应用。


2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，农杆菌转化载体是带有T-DNA的农杆菌双元转化载体，其中所述NopP的编码基因在载体中与启动子可操作连接形成表达元件以便能正常表达；更优选地所述表达元件插入到T-DNA序列的多克隆位点。


3.一种基于根瘤菌III型效应因子NopP的编码基因的农杆菌转化载体，其中所述NopP的编码基因在载体中与启动子可操作连接形成表达元件以便能正常表达，优选为带有T-DNA的农杆菌双元转化载体，更具体为发根农杆菌双元转化载体，进一步的所述表达元件插入到T-DNA序列的多克隆位点。


4.如权利要求1所述的农杆菌转化载体，其特征在于，所述NopP的编码基因在载体中与增强型双35S启动子可操作连接。


5.如权利要求3或4所述的农...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢致平，史德海林·奥斯丁·巴特瑟，王琰，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：广东;44