检测线粒体膜电势的可遗传荧光探针及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种检测线粒体膜电势的可遗传荧光探针及其应用，该荧光探针是由PINK1基因截短片段和荧光蛋白基因融合所得，最为优选的PINK1基因截短片段为SEQ IDNO.1所示的野生型PINK1基因序列的1‑390bp。本发明专利技术所提供的荧光探针具有制备方法简单，易储存，生物毒性低等优点；基于可遗传的特点，该线粒体膜电势探针应用面广泛，结合现代成像技术，可以快速灵敏的对目标细胞、组织、器官甚至是生命体的线粒体膜电势进行准确测量。

【技术实现步骤摘要】
检测线粒体膜电势的可遗传荧光探针及其应用
本专利技术属于细胞生物学领域,具体涉及一种检测线粒体膜电势的可遗传荧光探针及其应用。
技术介绍
线粒体通过氧化呼吸链来合成ATP。在氧化呼吸链中，电子由NADH，FADH2递氢体传递到呼吸链复合物，同时将质子主动运输到内膜外。内膜内外质子浓度梯度和跨膜电位差所储存的电化学势能即为线粒体膜电势，发挥着促使质子返回线粒体内膜，推动ATP合成酶合成ATP的作用。线粒体膜电势的维持是健康线粒体发挥正常功能从而维护细胞稳态的必要条件。膜电势的异常不仅会阻碍氧化磷酸化的正常进行，还可以激活线粒体自噬通路来消除功能异常的线粒体。在多种疾病和病理情况下均检测到细胞中线粒体膜电势的异常，因此对线粒体膜电势变化的检测有助于我们加深对于疾病发展的进一步理解，有着重要的科学意义和现实意义。对于线粒体膜电势的检测主要有电化学方法和荧光成像等方法。电化学方法主要是利用微电极准确测量线粒体内膜内外的电势差，具有很好的准确性。但由于线粒体体积小，难以精准的嵌入微电极，限制了电化学方法进行。荧光成像方法的主要原理是在细胞中线粒体膜电势发生改变后，其荧光染料在细胞中的荧光性质会发生一定的改变，从而根据荧光信号的改变来间接反映线粒体的膜电势。荧光染料对于线粒体膜电势的测量具有简单、方便、对细胞损伤较小等优点，因而被广泛应用于科学研究当中。目前，JC-1是常用于检测线粒体膜电势的荧光探针。正常线粒体膜电势情况下，JC-1在线粒体中呈现聚集态，发出橘红色的荧光，而在低线粒体膜电势的情况下，JC-1在线粒体中呈现单体态，发出绿色荧光，因此JC-1可通过荧光颜色的变化反映线粒体膜电势的变化。然而，作为可跨越线粒体膜的染料，外源添加JC-1等荧光染料对于线粒体具有潜在的影响。同时，目前的检测线粒体膜电势荧光成像方法不具有可遗传性，难以对疾病的全程，整体进行观测。因此，开发一种可遗传检测线粒体膜电势荧光探针是非常必要的。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种检测线粒体膜电势的可遗传荧光探针；本专利技术的目的之二在于提供含有所述荧光探针的重组质粒；本专利技术的目的之三在于提供含有所述重组质粒的转化体；本专利技术的目的之四在于提供所述荧光探针检测线粒体膜电势的方法；本专利技术的目的之五在于提供所述荧光探针在检测线粒体膜电势降低中的应用；本专利技术的目的之六在于提供所述荧光探针在标记线粒体在活细胞中的分布中的应用。为达到上述目的，本专利技术提供如下技术方案：1、一种检测线粒体膜电势的可遗传荧光探针，所述荧光探针是由PINK1基因截短片段和荧光蛋白基因融合所得，所述PINK1基因截短片段为SEQIDNO.1所示的野生型PINK1基因序列的1-390bp或1-240bp。本专利技术中优选的，所述PINK1基因截短片段为SEQIDNO.1所示的野生型PINK1基因序列的1-390bp。本专利技术中优选的，所述荧光蛋白基因为红色荧光蛋白基因。本专利技术中更为优选的，所述红色荧光蛋白基因的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。2、含有所述荧光探针的重组质粒。本专利技术中优选的，所述重组质粒为将所述的荧光探针的核苷酸序列插入到pCMV载体或pcDNA载体的多克隆位点处。3、含有所述重组质粒的转化体。4、所述的荧光探针检测线粒体膜电势变化的方法，其特征在于：用含有所述荧光探针的重组质粒转染动物细胞或动物体，根据线粒体外膜上的荧光强度变化判断线粒体膜电势的变化。5、所述荧光探针在检测线粒体膜电势降低中的应用。6、所述荧光探针在标记线粒体在活细胞中的分布中的应用。本专利技术的有益效果在于：本专利技术提供了一种检测线粒体膜电势可遗传荧光探针及其应用，该荧光探针是由PINK1基因截短片段和荧光蛋白基因融合所得，最为优选的PINK1基因截短片段为SEQIDNO.1所示的野生型PINK1基因序列的1-390bp。本专利技术所提供的荧光探针可通过质粒转染等方式编入宿主基因组中从而具有可遗传性，而且该荧光探针在线粒体氧化磷酸化解偶联试剂处理两小时后即有明显的效应，在利用模式动物研究线粒体膜电势作用及应用领域具有极大的潜力；并且该荧光探针具有制备方法简单，易储存，生物毒性低等优点；基于可遗传的特点，该线粒体膜电势探针应用面广泛，结合现代成像技术，可以快速灵敏的对目标细胞、组织、器官甚至是生命体的线粒体膜电势进行准确测量。附图说明为了使本专利技术的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本专利技术提供如下附图进行说明：图1为重组载体pcDNA3.1(+)-PINK1-mRFP和pcDNA3.1(+)-TOM20-GFP共同转染Hela细胞后共定位图；图2为重组载体pcDNA3.1(+)-gMPOR的基因序列图谱和质粒图谱。具体实施方式下面结合附图和具体实施例对本专利技术作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本专利技术并能予以实施，但所举实施例不作为对本专利技术的限定。除非特别说明，下述实施例中使用的试剂原料为常规市购或商业途径获得的生化试剂原料，使用的实验仪器均为实验室常规仪器。除非特别说明，下述实施例中使用的方法和设备为本领域常规使用的方法和设备。实施例1、野生型PINK1基因及重组质粒的获得在NCBI上公布的人磷酸酶及张力蛋白同源物(PTEN)诱导的激酶1(PTEN-inducedkinase1，PINK1)基因的序列，如SEQIDNO.1所示(GeneID:65018)，利用NCBI工具primerBLAST选择到特异性引物，具体引物序列如下：PINK1-F：gaattcatggcggtgcgacaggcgctgg(SEQIDNO.2)；PINK1-R：gcggccgctcacagggctgccctccatgag(SEQIDNO.3)在前向引物ATG前增加GAATTC(EcoRI酶切位点)，在其反向引物终止密码子TGA后增加gcggccgc(NotI酶切位点)，引物由北京华大基因科技有限公司合成所得。随后，利用PCR从HEK293T细胞的cDNA进行扩增获得野生型PINK1基因，之后用限制性内切酶EcoRI和NotI对野生型PINK1基因进行双酶切，同时，使用限制性内切酶EcoRI和NotI对pcDNA3.1(+)载体进行双酶切，使用凝胶纯化试剂盒将酶切产物纯化，并用T4连接酶将两个产物连接，将连接产物转入E.coliDH5α感受态细胞中，提取质粒，酶切鉴定，测序鉴定确定载体构建成功，命名为pcDNA3.1(+)-wtPINK1。实施例2、红色荧光蛋白基因及重组质粒的获得从实验室保存的质粒pcDNA3.1(+)-RFP中获取到如SEQIDNO.4所示的红色荧光蛋白序列，在起始密码子ATG前增加gcggccgcggccacc(NotI酶切位点和Kozak序列)，在终止密码子后增加TCTAGA(XbaI酶切位点)，设计相应引物后，引物由北京华大基因科技有限公司合成所得，具体引物序列如下：mR本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测线粒体膜电势的可遗传荧光探针，其特征在于：所述荧光探针是由PINK1基因截短片段和荧光蛋白基因融合所得，所述PINK1基因截短片段为SEQ ID NO.1所示的野生型PINK1基因序列的1-390bp或1-240bp。/n

【技术特征摘要】
1.一种检测线粒体膜电势的可遗传荧光探针，其特征在于：所述荧光探针是由PINK1基因截短片段和荧光蛋白基因融合所得，所述PINK1基因截短片段为SEQIDNO.1所示的野生型PINK1基因序列的1-390bp或1-240bp。


2.根据权利要求1所述的荧光探针，其特征在于：所述PINK1基因截短片段为SEQIDNO.1所示的野生型PINK1基因序列的1-390bp。


3.根据权利要求1所述的荧光探针，其特征在于：所述荧光蛋白基因为红色荧光蛋白基因。


4.根据权利要求3所述的荧光探针，其特征在于：所述红色荧光蛋白基因的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。


5.含有权利要求1～4任一项所述的荧光...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄增益，张子元，王虹，任肃霞，程志，刘德一，徐超英，谭欣，谭力，
申请(专利权)人：重庆医科大学，
类型：发明
国别省市：重庆;50