α-1,2-岩藻糖基转移酶及其应用制造技术

本发明专利技术具体涉及一种α‑1,2‑岩藻糖基转移酶及其应用，属于生物工程技术领域，所述α‑1,2‑岩藻糖基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，具有催化GDP‑L‑岩藻糖产生岩藻糖基乳糖的能力，为岩藻糖基转移酶的酶库提供新的选择，并为岩藻糖基转移酶定向进化提供新的起点。

【技术实现步骤摘要】
α-1,2-岩藻糖基转移酶及其应用
本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种α-1,2-岩藻糖基转移酶及应用。
技术介绍
2’-岩藻糖基乳糖是一种新型稀有母乳寡糖，具有选择性刺激肠道益生菌的生长，阻止病原菌对小肠上皮细胞的粘附从而保护婴幼儿肠道健康，提高免疫系统等生理功能。目前2’-岩藻糖基乳糖已经被欧盟，FDA等批准为婴幼儿奶粉添加剂，具有广阔的应用前景。α-1,2-岩藻糖基转移酶(α1,2-fucosyltransferase,FucT)是催化合成2’-岩藻糖基乳糖的关键酶，负责将供体GDP-L-岩藻糖转移到受体分子乳糖。虽然已经有报道多条α-1,2-岩藻糖基转移酶。但是大多数α-1,2-岩藻糖基转移酶在大肠杆菌中可溶性表达量很低，限制了大规模合成2’-岩藻糖基乳糖。寻找可溶性表达及酶活较高α-1,2-岩藻糖基转移酶，也是提高2’-岩藻糖基乳糖产量的重要手段。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的之一在于提供一种α-1,2-岩藻糖基转移酶，本专利技术的目的之二在于提供一种编码α-1,2-岩藻糖基转移酶的基因，本专利技术的目的之三在于提供一种重组表达载体，本专利技术的目的之四在于提供一种重组表达载体的构建方法，本专利技术目的之五在于提供一种基因工程菌，本专利技术的目的之六在于提供一种α-1,2-岩藻糖基转移酶在催化GDP-L-岩藻糖形成2’-岩藻糖基乳糖中的应用。为达到上述目的，本专利技术提供如下技术方案：1、一种α-1,2-岩藻糖基转移酶，所述α-1,2-岩藻糖基转移酶氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。2、一种编码α-1,2-岩藻糖基转移酶的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。3、一种重组表达载体，所述载体包含所述的α-1,2-岩藻糖基转移酶的核苷酸序列。4、一种重组表达载体的构建方法，所述方法为，以菌株Kosakoniasp.ZX03CCTCCM2018092为模板，用上、下游引物扩增编码α-1,2-岩藻糖基转移酶的基因，再与表达载体连接，得到重组表达载体，所述上游引物核苷酸序列为SEQIDNO.5，所述下游引物核苷酸序列为SEQIDNO.6。作为优选的技术方案之一，所述载体的结构骨架为pET21C。5、一种基因工程菌，所述基因工程菌由所述重组表达载体转化至宿主细胞中获得。6、利用α-1,2-岩藻糖基转移酶在催化GDP-L-岩藻糖形成2’-岩藻糖基乳糖中的应用。有益效果：本专利技术发现了一种新的α-1,2-岩藻糖基转移酶，具有催化GDP-fucose产生岩藻糖基乳糖的能力，为岩藻糖基转移酶的酶库提供新的选择，并为岩藻糖基转移酶定向进化提供新的起点。生物材料保藏菌株Kosakoniasp.ZX03于2018年3月2日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号)，保藏编号为CCTCCM2018092。附图说明图1为不同α-1,2-岩藻糖基转移酶蛋白同源性比对；图2为pET-FKP质粒构建图；图3为质粒构建电泳图，A为pET-FutCks质粒构建图，B为pET-FutCks-FKP质粒构建图；图4为pET-FutCks-FKP质粒构建图谱；图5为FutCks蛋白电泳图，T为菌液全蛋白，S为上清，I为沉淀；图6为重组菌株生产2’-岩藻糖基乳糖的液相检测结果图。具体实施方式下面将结合附图，对本专利技术的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1α-1,2-岩藻糖基转移酶的发现(1)α-1,2-岩藻糖基转移酶蛋白同源性比对将幽门螺旋杆菌的α-1,2-岩藻糖基转移酶FutC的蛋白序列与菌株Kosakoniasp.ZX03CCTCCM2018092的蛋白序列进行blastP比对分析。结果如表1所示，菌株Kosakoniasp.ZX03CCTCCM2018092基因组存在与FutC蛋白序列相似度为29.642％的蛋白序列，将其命名为FutCks，氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，这条蛋白序列与进行比对的序列同源性并不高，但是它的E值以及得分非常高，表明这条蛋白可能是α-1,2-岩藻糖基转移酶。表1α-1,2-岩藻糖基转移酶蛋白比对结果(2)α-1,2-岩藻糖基转移酶蛋白核心基序比对不同来源的α-1,2-岩藻糖基转移酶的同源性都存在较低的同源性，而这些α-1,2-岩藻糖基转移酶只要有共同的催化基序就可以行使α-1,2-岩藻糖基转移酶的功能，进一步对FutCks蛋白序列与已经报道的α-1,2-岩藻糖基转移酶利用Geneious比对分析，结果如图1所示，FutCks蛋白序列与文献报道的α-1,2-岩藻糖基转移酶有着共同的基序，这也表明FutCks蛋白序列可能具有α-1,2-岩藻糖基转移酶的活性。实施例2α-1,2-岩藻糖基转移酶质粒构建(1)构建pET-FKP、pET-FutCks与pET-FutCks-FKP质粒利用岩藻糖经补救途径合成GDP-岩藻糖是一种产生岩藻糖供体的有效方式，这一步骤需要L-岩藻糖激酶/GDP-L-岩藻糖焦磷酸化酶双功能酶基因(FKP)的参与，因此，构建FKP与FutCks两个基因同时表达的质粒。由江苏金唯智生物经过密码子优化后合成，用引物FKP-F(SEQIDNO.3)和FKP-R(SEQIDNO.4)扩增FKP基因，PCR体系：PCR程序：获得PCR产物经过天根琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(增强型)纯化后，与经过NdeI和sacI双酶切的pET21C连接，构建pET-FKP质粒，构建结果如图2所示。用引物FutCks-F(SEQIDNO.5)和FutCks-R(SEQIDNO.6)扩增FutCks基因，PCR体系：PCR程序：获得PCR产物经过天根琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(增强型)纯化后，与经过NdeI和sacI双酶切的pET21C连接，构建pET-FutCks质粒，结果如图3中A、B所示，菌落PCR结果显示，成功构建pET-FutCks质粒(图3中A)，双酶切结果也显示pET-FutCks质粒条带大小正确(图3中B)。将构建成功的质粒pET-FutCks与pET-FKP通过同尾酶连接BioBricK的方法连接起来，构建pET-FutCks-FKP，构建图谱如图4所示。pET-FutCks酶切体系：pET-FKP酶切体系：获得酶切产物经过天根琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(增强型)纯化后，用T4连接酶(NewEnglandBiolabs，M0202V)连接，反应条件：1×T4DNA连接酶反应缓冲液中，加入1μlDNALigase，双酶切的pET-FutCk本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种α-1,2-岩藻糖基转移酶，其特征在于，所述α-1,2-岩藻糖基转移酶氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种α-1,2-岩藻糖基转移酶，其特征在于，所述α-1,2-岩藻糖基转移酶氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。


2.一种编码权利要求1所述的α-1,2-岩藻糖基转移酶的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。


3.一种重组表达载体，其特征在于，所述载体包含权利要求2中所述的α-1,2-岩藻糖基转移酶的核苷酸序列。


4.权利要求3所述重组表达载体的构建方法，其特征在于，所述方法为，以菌株Kosakoniasp.ZX03CCTCCM2018092...

【专利技术属性】
技术研发人员：邹祥，牛松峰，马巍，哈丽媛，
申请(专利权)人：西南大学，
类型：发明
国别省市：重庆;50