一种靶蛋白递送载体的制备方法技术

本发明专利技术提供了一种高效包裹天然靶蛋白递送载体的制备方法，属于细胞工程技术领域。通过基因工程对宿主细胞进行光敏蛋白质改造，将两种对应的光敏蛋白分别与细胞膜特异性结合蛋白和靶蛋白构建为融合蛋白，在特定光照下利用物理挤压方式使宿主细胞膜再融合，获取重组细胞来源的包裹天然靶蛋白的细胞膜纳米囊泡，该递送载体能够将天然靶蛋白通过细胞膜有效递送至细胞内部。本发明专利技术的细胞膜纳米囊泡具有装载效率高、可大批量制备、操作简单、递送效率高等优点，为后续靶蛋白作为治疗药物在细胞内部发挥作用提供了新方法。

【技术实现步骤摘要】
一种靶蛋白递送载体的制备方法
本专利技术属于细胞工程
，具体涉及一种高效天然靶蛋白递送载体的制备方法。
技术介绍
蛋白质是生命体的重要组成成分，在细胞内发挥重要功能，包括酶催化、信号转导和基因调控等，帮助细胞在存活和程序性死亡之间保持良好的平衡。向细胞内递送功能蛋白在生物学应用中具有重要的治疗意义，包括疾病治疗、疫苗接种和生物成像。随着科技的进步，蛋白质类药物是每年上市的药物的重要组成部分，目前广泛用于治疗或缓解与许多代谢和肿瘤疾病相关的症状。尽管有大量的蛋白药物可以用于临床疾病治疗，但是由于功能蛋白进入细胞内的过程限制，导致蛋白药物(包括细胞因子，激素和单克隆抗体等)研发仍主要集中在胞外。近年来，随着细胞内蛋白药物功能被不断发现，设计一种稳定有效的递送载体以便将这些药物输送到靶细胞内部与药物本身一样重要。因此，亟须开发一种高效将靶蛋白递送至细胞内的载体系统。
技术实现思路
鉴于此，本专利技术的目的是提供一种高效包裹天然靶蛋白递送载体的制备方法，用于解决通过细胞膜向细胞内部运送蛋白药物的问题。通过基因工程对宿主细胞进行光敏蛋白质改造，基于对应的光敏蛋白在特定光照条件下可逆结合特性，将两种对应的光敏蛋白分别与细胞膜特异性结合蛋白和靶蛋白构建为融合蛋白，在特定光照下利用物理挤压方式使宿主细胞膜再融合，获取重组细胞来源的包裹天然靶蛋白的细胞膜纳米囊泡，该递送载体能够将天然靶蛋白通过细胞膜有效递送至细胞内部。本专利技术目的是通过以下方式实现：一种靶蛋白递送载体的制备方法，包括以下步骤：(1)通过基因工程手段构建重组细胞，所述重组细胞表达第一融合蛋白和第二融合蛋白，所述第一融合蛋白包含细胞膜特异性结合蛋白和第一光敏蛋白，所述第二融合蛋白包含靶蛋白与第二光敏蛋白，所述第一光敏蛋白和第二光敏蛋白在特定光的照射条件下能够可逆结合；(2)在特定光的照射条件下，通过物理挤压方式使步骤(1)制备的重组细胞的细胞膜再融合，获得细胞膜纳米囊泡。基于以上技术方案，进一步地，步骤(1)所述构建重组细胞的具体过程为通过转化或转染方式向宿主细胞内依次导入所述第一融合蛋白的编码基因和第二融合蛋白的编码基因。基于以上技术方案，进一步地，所述转染的具体步骤包括通过脂质体或聚合物转染试剂将携带所述第一融合蛋白的编码基因的重组慢病毒和携带所述第二融合蛋白的编码基因的重组慢病毒依次转染到宿主细胞内。基于以上技术方案，进一步地，步骤(2)中所述物理挤压方式的具体步骤包括将所述重组细胞的细胞悬液在特定光的照射下，通过挤出器依次通过10um、5um、1um孔径尺寸的滤膜，反复挤出5～20次，收集所得混悬液，于0～4℃，1000～5000g离心5～30min，取上清，于0～4℃，10000～30000g离心5～30min，弃上清，所得沉淀用缓冲液重悬得到细胞膜纳米囊泡。基于以上技术方案，进一步地，所述特定光的波长为460～650nm。基于以上技术方案，进一步地，所述细胞膜特异性结合蛋白选自CD9，CD63，CD81，CD82，调亡诱导因子6相互作用蛋白(ALIX)和肿瘤易感基因101蛋白(TSG101)中的任意一种。基于以上技术方案，进一步地，所述光敏蛋白选自重组人钙-整合素结合蛋白1(CIB)、CIBN、光敏色素(PhyB)、光敏色素互作因子(PIF)、光周期开花时间调节剂(FKF1)、时钟蛋白(GIGANTEA)、隐花色素(CRY)和光修复酶(PHR)中的任意一种。基于以上技术方案，进一步地，所述第一光敏蛋白为CIB或CIBN，所述第二光敏蛋白为CRY或PHR，通过照射波长为460～490nm的光使所述第一光敏蛋白和第二光敏蛋白结合。基于以上技术方案，进一步地，所述第一光敏蛋白为PhyB，所述第二光敏蛋白为PIF，通过照射波长为600～650nm的光来使所述第一光敏蛋白和第二光敏蛋白结合。基于以上技术方案，进一步地，所述第一光敏蛋白为GIGANTEA，所述第二光敏蛋白为FKF1，通过照射波长为460～490nm的光来使所述第一光敏蛋白和第二光敏蛋白结合。基于以上技术方案，进一步地，所述宿主细胞选自293T细胞、B-淋巴细胞、T-淋巴细胞、树突细胞、巨核细胞、巨噬细胞、干细胞及肿瘤细胞中的任意一种。本专利技术另一方面提供一种细胞膜纳米囊泡，所述细胞膜纳米囊泡是由上述制备方法制得。本专利技术另一方面提供一种蛋白质药物组合物，所述药物组合物包含上述细胞膜纳米囊泡，并利用细胞膜纳米囊泡将天然靶蛋白递送至细胞内部发挥作用。本专利技术相对于现有技术具有的有益效果如下：1.本专利技术提供的工程化天然靶蛋白递送载体的制备方法是本专利技术人首先开发并提出的，能够高效制备包含天然靶蛋白的工程化细胞膜纳米囊泡，靶蛋白在载体内以游离形式存在，因此可以广泛应用于疾病的治疗。2.本专利技术制备的细胞膜纳米囊泡具有装载效率高、可大批量制备、操作简单、靶蛋白与载体可逆性结合、递送效率高等优点。3.本专利技术建立了一整套细胞膜运输天然靶蛋白的递送体系，为后续靶蛋白作为治疗药物在细胞内部发挥作用提供了新的操作方案。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例，下面将对实施例涉及的附图进行简单地介绍。图1为本专利技术工程化天然靶蛋白递送载体的制备方法流程图；图2为本专利技术实施例1所述编码两种融合蛋白的慢病毒表达载体图谱；图3为本专利技术实施例1所述流式细胞术鉴定重组细胞病毒转染情况图；图4为本专利技术实施例1所述重组细胞在特定光照情况下胞内光敏蛋白结合情况图，其中，1：CD9-EGFP-CIBN融合蛋白，2：mcherry-CRY2融合蛋白，3：488nm波长光激发后，mcherry-CRY2融合蛋白向细胞膜处聚集分布，4：CD9-EGFP-CIBN融合蛋白和mcherry-CRY2融合蛋白重叠分布位置；图5为本专利技术工程化天然靶蛋白递送载体的制备方法中制备工程化载体布局图；图6为实施例1制备的包裹靶蛋白细胞膜纳米囊泡透射电镜图；图7为实施例1所述制备方法制得的包裹靶蛋白细胞膜纳米囊泡粒径分布图；图8为免疫荧光蛋白检测在特定光照条件下和不照光情况下制备的细胞膜纳米囊泡包裹靶蛋白效率图；图9为实施例2制备的细胞膜纳米囊泡向细胞内传递靶蛋白效率图。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术进行详细的说明，但本专利技术的实施方式不限于此，显而易见地，下面描述中的实施例仅是本专利技术的部分实施例，对于本领域技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，获得其他的类似的实施例均落入本专利技术的保护范围。为确认宿主细胞是否改造成功，使用融合蛋白共同表达标签蛋白，所述标签蛋白是为了确认宿主细胞是否改造成功而使用，例如使用绿色荧光蛋白作为第一融合蛋白标签蛋白，红色荧光蛋白作为第二融合蛋白标签蛋白。同样，使用标签蛋白作为靶蛋白来确认重组细胞制备的细胞膜纳米囊泡包裹靶蛋白效果，通过确认细胞膜纳米囊泡中是否检测到红色荧光蛋白本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种靶蛋白递送载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：/n(1)通过基因工程手段构建重组细胞，所述重组细胞表达第一融合蛋白和第二融合蛋白，所述第一融合蛋白包含细胞膜特异性结合蛋白和第一光敏蛋白，所述第二融合蛋白包含靶蛋白与第二光敏蛋白，所述第一光敏蛋白和第二光敏蛋白在特定光的照射条件下能够可逆结合；/n(2)在特定光的照射条件下，通过物理挤压方式使步骤(1)制备的重组细胞的细胞膜再融合，获得细胞膜纳米囊泡。/n

【技术特征摘要】
20210428 CN 20211048908011.一种靶蛋白递送载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)通过基因工程手段构建重组细胞，所述重组细胞表达第一融合蛋白和第二融合蛋白，所述第一融合蛋白包含细胞膜特异性结合蛋白和第一光敏蛋白，所述第二融合蛋白包含靶蛋白与第二光敏蛋白，所述第一光敏蛋白和第二光敏蛋白在特定光的照射条件下能够可逆结合；
(2)在特定光的照射条件下，通过物理挤压方式使步骤(1)制备的重组细胞的细胞膜再融合，获得细胞膜纳米囊泡。


2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述构建重组细胞的具体过程为通过转化或转染方式向宿主细胞内依次导入所述第一融合蛋白的编码基因和第二融合蛋白的编码基因。


3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述转染的具体步骤包括通过脂质体或聚合物转染试剂将携带所述第一融合蛋白的编码基因的重组慢病毒和携带所述第二融合蛋白的编码基因的重组慢病毒依次转染到宿主细胞内。


4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述物理挤压方式的具体步骤包括将所述重组细胞的细胞悬液在特定光的照射下，通过挤出器依次通过10um、5um、1um孔径的滤膜，反复挤出5～20次，收集所得混悬液，于0～4℃，1000～5000g离心5～30min，取上清，于0～4℃，10000～30000g离心5～30min，弃上清，所得沉...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘晶，王亮，王佳一，沈丽明，康琳，
申请(专利权)人：大连干细胞与精准医学创新研究院，
类型：发明
国别省市：辽宁;21