一种硫酸软骨素的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种硫酸软骨素的制备方法，属于生物技术领域。本申请以畜禽来源的软骨和/或气管为原料，集现代生物酶解技术和分离提取技术，制备高纯度的硫酸软骨素和蛋白肽。其过程为：将软骨和/或气管的混合物置于反应罐中蒸煮，加入氢氧化钠调节pH值8.0‑9.5，再加入胰蛋白酶和脂肪酶进行一级酶解，初步除杂；继而加入复合蛋白酶进行二级酶解，特异性水解蛋白。酶解液经过滤，上清液通过超滤、浓缩、干燥得到高纯度的硫酸软骨素。超滤透过液经纳滤脱盐、浓缩干燥得到胶原蛋白寡肽。利用连续二级酶解、膜分离技术实现硫酸软骨素和蛋白肽的高效分离制备，工艺简单易操作，生产周期短，产品纯度高，适合工厂生产应用。

【技术实现步骤摘要】
一种硫酸软骨素的制备方法
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种动物软骨和气管中硫酸软骨素的提取方法。
技术介绍
硫酸软骨素（CS）是一种酸性粘多糖，其基本单位是D-葡萄糖醛酸和N-乙酰-D-氨基半乳糖硫酸酯。硫酸软骨素一般含有50-70个双糖基本结构，分子量约为10-50kDa。硫酸软骨素具有不同的生理活性，可广泛应用于医疗、药品、食品、化妆品等行业中。在临床上，硫酸软骨素由于其良好的抗炎性可用于治疗神经痛、关节炎、以及促进溃疡愈合等疾病，在食品工业中，可作为膳食补充剂。目前，国内外对鱼、猪、牛、羊等动物软骨中硫酸软骨素的提取方法进行了大量的研究，但在以软骨及气管混合物为原料制备硫酸软骨素的研究较少。鸡鸭等家禽生长周期短，养殖量大，屠宰加工的副产品软骨的硫酸软骨素含量高。而猪气管作为屠宰后的副产物，也含有丰富的硫酸软骨素，但屠宰后常被作为废弃物处理，未能充分利用。硫酸软骨素以蛋白聚糖的形式存在于软骨中，软骨膜和软骨基质中分别含有大量的Ⅰ型胶原和Ⅱ型胶原。因此，在硫酸软骨素的提取过程中主要去除的杂质是蛋白质，通过破坏糖与肽之间的糖苷键，从而使硫酸软骨素从糖蛋白中释放出来。现有工艺中常采用碱提取、酶解、超声辅助等提取硫酸软骨素，碱法提取主要是破坏多糖链与蛋白质之间的共价键，使蛋白多糖的糖-肽键断裂，从而将硫酸软骨素释放出来；碱的浓度对硫酸软骨素的产率和纯度影响很大，碱液浓度小，制备硫酸软骨素的生产周期长，制备的样品溶液较混浊。原因在于稀碱温和条件下软骨中的胶原蛋白、粘蛋白等不能完全水解，且它在中性盐和弱酸溶液中是可溶的，在溶液中不易被除去，同时由于产品中小分子杂质如多肽等易随同硫酸软骨素沉淀，因而会影响产品产率和纯度。若碱液浓度过大，硫酸软骨素易降解为分子量较小的低聚糖，且颜色深。因此需加入酶协同提取，酶的作用是利用蛋白酶水解蛋白质的特异性，使胶原蛋白和粘蛋白等水解成氨基酸；加入蛋白酶降解时，由于反应条件温和，不会使硫酸软骨素发生降解，从而保证了硫酸软骨素的活性；同时可使溶液中及硫酸软骨素长链上的蛋白质进一步水解，生成可溶性小分子肽、氨基酸等物质。在生产硫酸软骨素过程中，因其主要以蛋白多糖形式存在，蛋白质作为硫酸软骨素中最主要的杂质之一，必须尽可能除去。一般情况下通过一次酶解，产品的含氮量很难达到要求，而采用复合酶可以加强水解，且所用酶类应选择作用肽键广泛的酶，有利于取得较好的酶解效果。通常酶解后得到的产物在加工过程中被当做废水排出，既污染环境也浪费了宝贵资源，因此需要对酶解后的小分子肽进行充分的回收利用，进行高值化利用，提高原料的综合利用价值。动物软骨或气管化学成分复杂，含脂肪、糖原等多种大分子物质，干扰硫酸软骨素的分离和纯化，因此也需要通过胶原蛋白酶、脂肪酶等特异性的酶降解原料中的杂质，提高硫酸软骨素的纯度。中国专利CN111253503A公开了一种超声辅助碱盐-酶解法在鳐鱼中提取硫酸软骨素的方法，超声时间180min，碱液浓度2.3%，酶解12h，最佳提取率可达到43.32%。虽提取率较高，但较难应用于大规模生产。专利CN110922503A公开了一种在猪牛鼻骨中提取硫酸软骨素的工艺，软骨粉碎后加入碱液调节pH值为10-14，15-20℃浸泡25-35h，固液分离后，在提取液中加入碱性蛋白酶、中性蛋白酶、脂肪酶、胰酶的复合酶反应5-10h，再进行分离纯化得到硫酸软骨素，纯度为93.5%~93.7%。该工艺采用了复合酶解法，但原料预处理耗时较长，而且需要保持浸泡时温度在15-20℃，耗能大。后期酶解分离的时间长，酶解效率不高。在专利CN109280095A中，将禽畜结缔组织水煮后，干燥粉碎，加入6倍体积的浓度为2~6%的碱液浸提，得碱提液，调节pH值至中性后再进行复合酶解（碱性蛋白酶、风味蛋白酶和脂肪酶），灭酶后再加入脂肪酶酶解得酶解液，经活性炭吸附和除蛋白得到硫酸软骨素，产率达12%以上，产品纯度达95.5%。该生产工艺采用碱提和复合酶二级酶解结合，得到的产品纯度高，但碱提过程需加入大量的碱液，而酶解过程又需加入酸调节适合pH，导致提取液中盐含量高，而且蛋白水解产物也未进行有效利用，增加废水处理难度，而吸附采用的活性炭也只能作为固废处理，造成资源浪费和环境污染。中国专利CN102533915B专利技术了一种酶解动物软骨制备硫酸软骨素和胶原蛋白多肽的方法，采用阴离子交换树脂回收胶原蛋白多肽，所得胶原蛋白多肽分子量集中在4000Da以下，实现了软骨的高值化利用。但离子交换树脂在工业生产中需消耗大量的盐洗脱剂，并且使用后需再生，操作繁琐。中国专利CN111533826A提出了一种从猪骨中同时提取硫酸软骨素和骨胶原蛋白肽的方法，在115~120℃、130~135℃分别进行两次原料的抽提，每次60min，再进行酶解。采用碱性蛋白酶和胰蛋白酶进行一次酶解2h，酶解液经树脂吸附3~5h、再洗脱除盐得到硫酸软骨素溶液；加入角蛋白酶、菠萝蛋白酶和中性蛋白酶进行二次酶解2h，经陶瓷膜（1000Da）过滤得到骨胶原蛋白肽。所得到的硫酸软骨素收率为17.8%-18.5%，纯度为99.8%以上，骨胶原蛋白肽收率在23.3-26.1%之间，分子量为150-600Da。该方法能获得较高纯度的硫酸软骨素，但抽提温度较高，时间较长，在抽提过程中容易破坏硫酸软骨素结构，可能导致降解或产物颜色加深。树脂吸附虽然特异性强，但洗脱和再生过程，需要耗费大量的资源，工厂生产的可操作性不强，能耗较大，成本较高。生产过程中需进行多次过滤分离，耗时长，生产连续性不高。对现有技术的分析，存在的问题及缺陷为：(1)现有工艺提取硫酸软骨素的方法中酶解专一性不高，酶解效率低。(2)现有工艺提取硫酸软骨素的方法中引入大量的酸碱试剂，增加了后续除盐负担，影响硫酸软骨素品质，影响企业生产的经济效益，并且造成环境污染。(3)现有工艺提取硫酸软骨素的方法中工艺繁琐，生产周期长，不适于工厂连续生产，可操作性不强。
技术实现思路
本专利技术旨在充分利用屠宰加工中的废弃物，采用二级酶解法充分水解蛋白质：一级酶解通过添加胰酶和脂肪酶复合酶水解糖-肽键的同时，也减少脂肪等杂质的干扰，进行初步分离；再继续通过二级酶解的复合蛋白酶充分水解蛋白质，得到高品质的硫酸软骨素和胶原蛋白寡肽，所得胶原蛋白寡肽集中分布在1000Da以下，该分子量范围的寡肽稳定性好，生物活性高。本专利技术工艺重在克服现有工艺中存在的酶解不完全，酶解时间长、过程参数不易控制、碱液浓度过高影响硫酸软骨素和胶原蛋白肽纯度的缺陷，结合超滤和纳滤分离技术纯化产品，减少环境污染和生产成本，提高了禽畜加工废弃物的综合利用价值，实现绿色环保经济的制备，适用于工业上大规模生产。本专利技术的目的可以通过以下技术方案来实现：一种动物软骨和/或气管中生产硫酸软骨素的方法，包括以下步骤：(1)清洗：软骨/气管按照质量比为1:1-1:5投入，清洗。(2)蒸煮：软骨及气管在蒸煮罐中加水浸没，升温至80-100℃进行水煮，保持1-3h，使软骨表面的肌肉组织剥离。(3)降温：蒸本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种硫酸软骨素的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：以动物软骨和/或气管混合物作为生产原料，采用连续二级复合酶解，经超滤分离，得到的超滤浓缩液经醇沉离心干燥后获得硫酸软骨素，超滤所得的透过液经纳滤膜处理后制备胶原蛋白寡肽产品。/n

【技术特征摘要】
1.一种硫酸软骨素的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：以动物软骨和/或气管混合物作为生产原料，采用连续二级复合酶解，经超滤分离，得到的超滤浓缩液经醇沉离心干燥后获得硫酸软骨素，超滤所得的透过液经纳滤膜处理后制备胶原蛋白寡肽产品。


2.根据权利要求1所述的一种硫酸软骨素的制备方法，其特征在于，所述的硫酸软骨素生产原料为鸡、鸭、猪或牛的软骨及气管混合物。


3.根据权利要求1所述的一种硫酸软骨素的制备方法，其特征在于，包括步骤：
（1）蒸煮降温：软骨及气管在蒸煮罐中加水浸没，升温至80-100℃进行水煮，保持1-3h，使软骨表面的肌肉组织剥离，蒸煮后的料液降温至45-55℃；
（2）一级酶解：加入氢氧化钠调节料液pH值为弱碱性，加入一级复合酶酶解，初步除杂；
（3）二级酶解：在步骤（2）的酶解液中加入复合蛋白酶进行连续二级酶解，特异性水解蛋白质，断裂糖-肽键，进一步纯化；
（4）...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵黎明，刘艳琼，李洁，张照照，张兴兴，
申请(专利权)人：山东广昊生物制品有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37