用于禽类疫苗生产的无血清培养基及其用途制造技术

本公开涉及一种用于原代细胞培养的方法。在补充有源自植物或蔬菜来源的肽和蛋白胨的无血清培养基中培养原代细胞。原代细胞培养的方法可以是扩增诸如痘病毒的病毒的方法中的一个步骤。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于禽类疫苗生产的无血清培养基及其用途相关信息本申请要求2019年1月17日提交的美国临时专利申请62/793,674的优先权，并通过引用将其全部包括在内。
本公开总体上涉及一种细胞培养基配方以及用于在培养中的细胞的病毒繁殖和增殖的方法，特别是用于生产疫苗。具体来讲，本公开提供了有助于促进用于禽类疫苗生产的初代或次代细胞培养物体外培养的无血清的确定的细胞培养基配方，其中生长培养基包含素食(vegetariandiet)。此外，本公开提供了使用无血清生长培养基进行在培养中的细胞的病毒繁殖和增殖的方法。本公开的培养基特别适合于成纤维细胞，例如鸡胚成纤维细胞的贴壁培养。
技术介绍
大多数病毒疫苗是通过细胞培养系统来生产的。在基于细胞培养的疫苗生产中，病毒产量至关重要，不仅因为更高的病毒产量使得更多的疫苗生产更快，而且因为这对于确定基于细胞培养的疫苗生产方法的经济可行性是重要的。用于病毒/疫苗生产的细胞可以是细胞系或原代动物。鸡胚成纤维细胞(CEF细胞)是用于病毒生产的原代细胞的一个例子。减毒病毒通常在CEF细胞培养中繁殖。体外细胞生长和繁殖需要培养条件，其包括可以支持细胞生长和繁殖的培养基。一般来说，用于培养哺乳动物来源的细胞所常用的细胞培养基包含富盐溶液，其含有维生素、氨基酸、必需微量元素和糖。另外，细胞生长所需的生长激素、酶和生物活性蛋白，通常以动物血来源的血清或可替代地从动物血来源的血清中分离出的蛋白质组分的形式作为补充剂而添加。动物血来源的血清制品的实例是胎牛血清、鸡血清、马血清和猪血清。这些血清来源于分级分离(fractionated)的血液，其中已经去除了红细胞和白细胞。原代细胞，比如CEF细胞甚至比细胞系更依赖于动物血清来源。因此，原代细胞通常在含有5％至10％血清的细胞培养基中培养，多数情况下该血清为胎牛血清(FCS)。动物血来源的血清制品可能含有外源性致病因子，例如病毒或朊蛋白。这些病原体可能会传播给待用疫苗或任何其他在补充有血清的细胞培养中生产的药物制品来治疗或接种的动物/人类，由于该潜在风险，由此也引发了使用血清的安全担忧。常用的牛血清补充剂例证了这些担忧，其中与其使用相关的许多主要问题/风险之一是将引起牛海绵状脑病(bovinespongiformencephalopathy，BSE)的因子传播给与从使用牛血清补充剂的细胞培养中生产的制品/疫苗接触的动物/人类的可能性。因此，使用无血清培养基是有优势的，以去除血清中的污染物，比如病毒或致病性朊蛋白，其一定不能留在例如重组蛋白或病毒疫苗载体的最终制品中。考虑到与在细胞培养中使用动物血清相关的可能风险，开发不含任何动物来源的蛋白质或肽的无血清培养基显然会是优选。具体来说，用从非动物来源分离的蛋白质、肽或脂类来替代动物来源的蛋白质或肽，将减少与血清相关的安全担忧。因此，仍然需要改善无血清疫苗生产的策略。专利技术概述本公开提供了无血清培养基，其能培养大范围的悬浮和单层细胞，同时能够支持禽类疫苗生产。本公开提供了无血清培养基，其包含各种无机盐、碳水化合物、氨基酸、缓冲剂、维生素和化合物以模拟自然细胞环境。如果需要，氨基酸、碳水化合物、盐类、维生素和化合物中的许多可从不含蛋白质或生长促进剂的市售合成培养基中获得，例如EMEM或DMEM。本公开提供了无血清培养基，其包含源自植物或蔬菜来源的胰蛋白胨(肽和蛋白胨)。此外，本公开还提供了使用无血清培养基培养细胞和细胞系用于病毒繁殖和增殖的方法。专利技术详述本公开的一个目的是开发一种无血清培养基，所述培养基能培养大范围的悬浮和单层细胞，同时能支持禽类疫苗生产。本公开的培养基还包括各种无机盐、碳水化合物、氨基酸、缓冲剂、维生素和化合物以模拟自然细胞环境。如果需要，氨基酸、碳水化合物、盐类、维生素和化合物中的许多可从不含蛋白质或生长促进剂的市售合成培养基中获得，例如EMEM或DMEM。除了上述的血清替代品之外，还可以向培养基中添加各种额外的氨基酸、盐类、碳水化合物、维生素和化合物，比如酵母提取物和抗生素，以组成本公开的完全无血清培养基。本公开的另一个目的涉及使用无血清培养基来培养细胞和细胞系用于病毒繁殖和增殖的过程。无血清培养基包括源自植物或蔬菜来源的胰蛋白胨(肽和蛋白胨)。本公开提供了一种在无血清培养基中培养原代细胞，特别是原代禽类细胞的方法，以及在无血清条件下在原代细胞中生产病毒的方法。用于培养原代细胞的本专利技术方法的特征可在于在补充有源自植物或蔬菜来源的肽和蛋白胨的无血清培养基中培养细胞。注意，在本公开中，尤其是在权利要求中，术语比如“包含”、“包含”、“包含”等可以意为“包括”、“包括”、“包括”等。术语“基本上由...组成”和“基本上由...组成”允许存在未明确表述的元件，但排除现有技术中发现的或影响本专利技术的基础的或新型的特征的元件。除非明确说明，技术术语按照惯例使用。分子生物学中常见术语的定义见于牛津大学出版社1994年出版的由BenjaminLewin编写的《GenesV》(ISBN0-19-854287-9)，BlackwellScienceLtd1994年出版的由Kendrew等人编写的《TheEncyclopediaofMolecularBiology》(ISBN0-632-02182-9)以及由VCH出版商1995年出版的由RobertA.Meyers编写的《MolecularBiologyandBiotechnology:aComprehensiveDeskReference》(ISBN1-56081-569-8)。除非上下文另有明确说明，单数名词“一”、“一个”和“该”包括复数指代。类似地，除非上下文另有明确说明，“或”一词旨在包括“和”。“或”一词指特定列表中的任何一个成员，也包括该列表中成员的任何组合。本文中使用的术语“原代细胞”是本领域技术人员众所周知的。不受限于以下定义，术语“原代细胞”可以指已经从动物或人类组织、器官或生物体中新鲜分离的细胞，其中细胞不能连续且无限地复制和分裂。通常情况下，原代细胞在细胞培养中分裂少于100次，经常是少于50次，经常是少于25次。因此，原代细胞没有经历永生化事件。原代细胞的例子是动物成纤维细胞，例如但不限于鸡胚成纤维细胞(CEF细胞)。分离原代细胞的方法是众所周知的。通常情况下，原代细胞培养物是通过使用蛋白酶处理组织、器官或胚胎以获得单细胞而直接源自组织、器官或胚胎的。本公开的方法不局限于形成单层的细胞。根据一个替代实施方案，本公开中的方法可以用于所有其他类型的原代细胞，比如自然生长于悬浮培养的细胞(例如淋巴细胞或其他类型的血细胞)或自然将作为贴壁细胞生长但已经适应在悬浮培养中生长的细胞。如下所示，细胞也可以用于可作为疫苗而有用的病毒的无血清扩增。一般来说，用作疫苗的病毒，包括野生型病毒、减毒病毒和重组病毒，是在含血清的条件下生长和扩增的。然而如上所述，存在血清含有致病因子可能传播给用疫苗治本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.培养基，所述培养基包括：不含人类或动物蛋白质的基础培养基，和植物蛋白来源。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20190117 US 62/793,6741.培养基，所述培养基包括：不含人类或动物蛋白质的基础培养基，和植物蛋白来源。


2.权利要求1的培养基，其中基础培养基是EMEM。


3.权利要求1的培养基，其中基础培养基是DMEM。


4.权利要求1的培养基，其中植物蛋白来源是植物来源的胰蛋白胨。


5.权利要求4的培养基，其中植物来源的胰蛋白胨是VEGITONE。


6.权利要求1的培养基，所述培养基还包括抗生素。


7.权利要求1的培养基，所述培养基还包括酵母提取物。


8.权利要求1的培养基，所述培养基还包括盐类。


9.权利要求1的培养基，所述培养基还包括碳水化合物。


10.权利要求1的培养基，所述培养基还包括额外的氨基酸。


11.权利要求1的培养基，所述培养基还包括一种或多种金属离子、维生素和辅...

【专利技术属性】
技术研发人员：W·T·休斯，
申请(专利权)人：勃林格殷格翰动物保健美国公司，
类型：发明
国别省市：美国;US