一种电化学免疫传感器及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种电化学传感器及其制备方法和应用。本发明专利技术的电化学传感器从下到上依次包括活化的丝网印刷碳电极、纳米金颗粒和蛋白A，所述蛋白A上修饰有诺如病毒衣壳蛋白单克隆抗体，所述蛋白A上的非特异性位点为封闭性位点。本发明专利技术的制备过程为：将丝网印刷碳电极活化后依次沉积纳米金颗粒、修饰蛋白A、修饰诺如病毒衣壳蛋白单克隆抗体、封闭非特异性位点后得到电化学传感器。本发明专利技术的电化学传感器对人源诺如病毒衣壳蛋白进行定量检测时，其线性检测范围为1～10ng/mL，检出限为0.635～1.0ng/mL。本发明专利技术的电化学免疫传感器操作方便、成本低廉、灵敏度高，适用于现场快速检测诺如病毒。

【技术实现步骤摘要】
一种电化学免疫传感器及其制备方法和应用
本专利技术涉及一种电化学免疫传感器及其制备方法和应用，属于电化学检测

技术介绍
诺如病毒(noroviruses，NoVs)又称诺瓦克病毒(NorwalkVirus)、类诺瓦克病毒(Norwalk-likevirus)或小圆状病毒(smallroundstructuredvirus,SRSV),直径约26-35nm，无包膜，为单股正链RNA病毒，易发生变异，隶属于单链RNA嵌杯状病毒科诺如病毒属。诺如病毒根据其主要衣壳蛋白编码区核苷酸序列的不同，共分为GI-GX十组，其中GI、GII、GIV属人类易感，称为人源诺如病毒(HuNoVs)。人源诺如病毒是引起世界范围内非细菌性急性胃肠炎的主要病原体之一。据调查，诺如病毒每年可导致全球1.25亿人次感染和3.5万人死亡，导致全球直接经济损失42亿美元，社会经济损失603亿美元，对全球造成了沉重的疾病负担，已经成为全球重要的公共卫生问题。由于仍缺乏成熟的体外培养模式和动物模型，严重阻碍了诺如病毒的研究进展。目前，对于诺如病毒尤其是人源诺如病毒的防控监测主要基于检测技术的发展与进步。现阶段最常用的诺如病毒检测方法是基于病毒核酸的反转录实时定量PCR技术(RT-qPCR)，近年来基于抗原抗体特异性的免疫学方法也得到了很大程度的发展，如免疫胶体金法。RT-qPCR技术虽然准确度高、灵敏度好，但是过程繁琐，耗时长，设备昂贵且对操作人员专业技术要求高。胶体金法虽便捷快速成本低，但其较低的灵敏度和高检出限限制了其推广和应用。与传统的诺如病毒检测方法相比，电化学免疫传感器因其操作简单、成本低廉、灵敏度高，适用于现场检测等诸多优点近年来受到了广泛关注，目前关于电化学传感器应用于诺如病毒检测的研究还存在欠缺。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是：现有的检测诺如病毒的方法存在过程繁琐、耗时长、设备昂贵且对操作人员专业技术要求高或是灵敏度低、检出限高等问题。为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种电化学免疫传感器，从下到上依次包括活化的丝网印刷碳电极、纳米金颗粒和蛋白A，所述蛋白A上修饰有单克隆抗体，所述蛋白A上的非特异性位点为封闭性位点；所述的单克隆抗体为诺如病毒衣壳蛋白单克隆抗体。本专利技术还提供了一种上述电化学免疫传感器的制备方法，包括以下步骤：步骤1：以循环伏安法将丝网印刷碳电极进行活化；步骤2：采用恒电位沉积的方法，在活化后的丝网印刷碳电极表面沉积纳米金颗粒，清洗后晾干备用；步骤3：取蛋白A的PBS稀释液滴在步骤2所得的丝网印刷碳电极表面，置于恒温湿盒中孵育，然后取出清洗、晾干，保存备用；步骤4：取单克隆抗体的PBS稀释液滴在步骤3所得的丝网印刷碳电极表面，置于恒温湿盒中孵育，然后取出清洗、晾干，保存备用；步骤5：取脱脂奶粉的PBS稀释液滴于步骤4所得的丝网印刷碳电极表面，置于恒温湿盒中孵育，封闭非特异性位点，然后取出清洗、晾干，得到电化学免疫传感器。优选地，所述步骤1的具体过程为：用移液枪吸取100μL0.2M的硫酸溶液滴在电极表面，以循环伏安法进行活化，扫描电位范围为-1.5～1.5V，扫描速度为0.1V/s，扫描10圈，循环伏安曲线稳定即表明活化完成，去离子水冲洗，室温晾干备用。优选地，所述步骤2中的沉积纳米金颗粒所采用的原料为150μL质量分数为0.15％的氯金酸溶液；所述的恒电位沉积的条件为：沉积电位-0.2V，沉积时长2400s。优选地，所述步骤3和步骤4中的PBS稀释液的浓度均为20μg/mL，用量均为10μL。优选地，所述步骤3和步骤4中的恒温湿盒的温度为37℃，所述孵育的时间为60min；所述的清洗、晾干具体为：采用PBS缓冲液和去离子水冲洗后室温晾干，所述保存的温度为4℃。优选地，所述步骤5的具体过程为：用移液枪吸取20μL质量分数为1％的脱脂奶粉的PBS稀释液于步骤4所得的丝网印刷碳电极表面，置于37℃恒温湿盒中孵育360min，然后取出以PBS缓冲液去离子水冲洗后室温晾干，即得到电化学免疫传感器。本专利技术还提供了所述的电化学免疫传感器在检测诺如病毒中的应用。优选地，所述应用包括用于定量检测人源诺如病毒，所述的定量检测为：首先将不同浓度的人源诺如病毒衣壳蛋白溶液滴于电化学传感器的电极表面，于恒温湿盒中孵育后，用差分脉冲伏安法进行检测，得到人源诺如病毒衣壳蛋白浓度-峰电流变化率的标准曲线，将待测样品同样采取差分脉冲伏安法进行检测，得到峰电流变化率，代入标准曲线，得到人源诺如病毒衣壳蛋白的浓度。优选地，所述的恒温湿盒的温度为37℃，所述孵育的时间为60min。优选地，所述人源诺如病毒衣壳蛋白的线性检测范围为1～10ng/mL，检出限为0.635～1.0ng/mL。与现有技术相比，本专利技术的有益效果在于：1.本专利技术的电化学免疫传感器操作方便、成本低廉、灵敏度高，适用于现场快速检测诺如病毒；且为一次性可抛弃型电化学免疫传感器，避免了交叉污染且有利于集中处理。2.本专利技术利用纳米金电信号放大及蛋白A定向结合抗体可结晶片段(Fc)而使抗体的抗原结合片段(Fab)充分暴露的优势，提高了检测的灵敏度和特异性；3.本专利技术的电化学免疫传感器是基于诺如病毒裂解后的衣壳蛋白而非有感染力的病毒粒子，保障了检测人员的人身安全；附图说明图1为本专利技术的的电化学免疫传感器的制备过程示意图；图2为本专利技术的制备过程中每一修饰步骤得到的电极在以0.1M硝酸钾为支持电解质的5mM铁氰化钾/亚铁氰化钾(1：1)溶液中的表征的Nyquist图，其中，插图为Randle等效电路；图3为本专利技术的电化学免疫传感器对人源诺如病毒进行检测的标准曲线。具体实施方式为使本专利技术更明显易懂，兹以优选实施例，并配合附图作详细说明如下。实施例一种电化学免疫传感器的制备方法，制备过程如图1所示，具体步骤包括：(1)丝网印刷碳电极(SPCE)的活化：用移液枪吸取100μL0.2M的硫酸溶液滴在电极表面，以循环伏安法进行活化，扫描电位范围为-1.5～1.5V，扫描速度为0.1V/s，扫描10圈，循环伏安曲线稳定即表明活化完成，去离子水冲洗，室温晾干备用；(2)电沉积纳米金颗粒(AuNPs)：用移液枪吸取150μL质量分数为0.15％的氯金酸溶液于步骤(1)活化好的工作电极表面，进行恒电位沉积，沉积电位为-0.2V，沉积时长为2400s，去离子水冲洗，室温晾干备用；(3)蛋白A的固定：用移液枪吸取10μL20μg/mL蛋白A的PBS稀释液于步骤(2)沉积好的工作电极表面，置于37℃恒温湿盒中40min，取出以PBS缓冲液和去离子水轻柔冲洗后室温晾干，4℃保存备用；(4)单克隆抗体的固定：用移液枪吸取10μL200μg/mL诺如病毒衣壳蛋白单克隆抗体的PBS稀释液于步骤(3)修饰好的工作电极表面，置于37℃恒温湿盒中60min，取出本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种电化学免疫传感器，其特征在于，从下到上依次包括活化的丝网印刷碳电极、纳米金颗粒和蛋白A，所述蛋白A上修饰有单克隆抗体，所述蛋白A上的非特异性位点为封闭性位点；所述的单克隆抗体为诺如病毒衣壳蛋白单克隆抗体。/n

【技术特征摘要】
1.一种电化学免疫传感器，其特征在于，从下到上依次包括活化的丝网印刷碳电极、纳米金颗粒和蛋白A，所述蛋白A上修饰有单克隆抗体，所述蛋白A上的非特异性位点为封闭性位点；所述的单克隆抗体为诺如病毒衣壳蛋白单克隆抗体。


2.权利要求1所述的电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：以循环伏安法将丝网印刷碳电极进行活化；
步骤2：采用恒电位沉积的方法，在活化后的丝网印刷碳电极表面沉积纳米金颗粒，清洗后晾干备用；
步骤3：取蛋白A的PBS稀释液滴在步骤2所得的丝网印刷碳电极表面，置于恒温湿盒中孵育，然后取出清洗、晾干，保存备用；
步骤4：取单克隆抗体的PBS稀释液滴在步骤3所得的丝网印刷碳电极表面，置于恒温湿盒中孵育，然后取出清洗、晾干，保存备用；
步骤5：取脱脂奶粉的PBS稀释液滴于步骤4所得的丝网印刷碳电极表面，置于恒温湿盒中孵育，封闭非特异性位点，然后取出清洗、晾干，得到电化学免疫传感器。


3.如权利要求2所述的电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于，所述步骤1的具体过程为：用移液枪吸取100μL0.2M的硫酸溶液滴在电极表面，以循环伏安法进行活化，扫描电位范围为-1.5～1.5V，扫描速度为0.1V/s，扫描10圈，循环伏安曲线稳定即表明活化完成，活化完成后去离子水冲洗，室温晾干备用。


4.如权利要求2所述的电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于，所述步骤2中的沉积纳米金颗粒所采用的原料为150μL质量分数为0.15％的氯金酸溶液；所述的恒电位沉积的条件为：沉积电位-0.2V，沉积时长2400s。


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【专利技术属性】
技术研发人员：李茜茜，王楠，王大鹏，荣绍丰，管世敏，
申请(专利权)人：上海应用技术大学，
类型：发明
国别省市：上海;31