一种绵羊H-FABP基因单倍型检测方法技术

本申请提供的一种绵羊H‑FABP基因单倍型检测方法，包括以下步骤：根据绵羊H‑FABP基因设计多重PCR引物；提取绵羊基因组DNA，并将提取后的DNA溶于TE缓冲液中于‑20℃保存；PCR体系设置，通过多重反应得到PCR产物；将所述PCR产物纯化，并设置延伸反应体系；将纯化后的PCR产物进行SNaPshot多重单碱基延伸反应得到纯化后的延伸产物；根据所述延伸产物进行测序与单倍体分型。本申请提供的一种绵羊H‑FABP基因单倍型检测方法，通过该方法可以自动检测绵羊H‑FABP基因以上紧密连锁的5个位点，可以筛选优势单倍型BB型(GG/CC/GG/GG/AA)个体。

【技术实现步骤摘要】
一种绵羊H-FABP基因单倍型检测方法
本申请涉及生物基因
，尤其涉及一种绵羊H-FABP基因单倍型检测方法。
技术介绍
心脏型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)是一种可溶性的小分子非酶蛋白质，其主要作用是在细胞内与脂肪酸结合，使细胞内外保持一定的浓度差，促使细胞摄取脂肪酸。H-FABP基因的遗传多态性与肉质性能，尤其是肌内脂肪和生长形状相关联，可作为影响IMF含量的候选基因。目前，宁夏及其周边区域由于放牧转为舍饲这种生产方式的改变，导致滩羊的二毛皮等级和肉品质均下降。迫切需要一种育种技术结合分子标记技术开展绵羊选育，来改善绵羊品质下降的问题。
技术实现思路
本申请提供了一种绵羊H-FABP基因单倍型检测方法，以解决宁夏及其周边区域由于放牧转为舍饲这种生产方式的改变，导致滩羊的二毛皮等级和肉品质均下降的问题。本申请提供的一种绵羊H-FABP基因单倍型检测方法，包括以下步骤：根据绵羊H-FABP基因设计多重PCR引物；提取绵羊基因组DNA，并将提取后的DNA溶于TE缓冲液中于-20℃保存；将提取后的绵羊基因组DNA与所述多重PCR引物加入PCR体系，通过多重反应得到PCR产物；将所述PCR产物纯化，并设置延伸反应体系；将纯化后的PCR产物进行SNaPshot多重单碱基延伸反应得到纯化后的延伸产物；根据所述延伸产物进行测序与单倍体分型。可选的，所述根据绵羊H-FABP基因设计多重PCR引物步骤中，所述PCR引物为：SNP29_32F：GAGACCACGGCAGATGACAGSNP29_32R：GACTCTTGCCTTTAGCACTTGGSNP39_41F：GAAAGTTCTCACCCGCCTCTTCTSNP39_41R：CTCCACAGGCAGGCTTCAATCSNP34F：GAAATAGTTGACGGGAAACTCATTCTSNP34R：AAAGCCCAAAGCCACGGTATTACSNP35_36F：CTGAAGGAGAGAGTGGTTGCAGAGSNP35_36R：GAAAGGGCTGTGCTGTCAGGGSNP42_46F：TCTTTCCACAGTCCATCGTGACACSNP42_46R：TTATGCAGAGGCGTGTACAAAGCC。可选的，所述提取绵羊基因组DNA，并将提取后的DNA溶于TE缓冲液中于-20℃保存的步骤还包括：DNA样本取1μL1％agarose电泳进行质量检查以及浓度预估，根据预估的浓度将样本稀释到工作浓度5-10ng/μL。可选的，所述PCR体系设置，通过多重反应得到PCR产物的步骤中所述PCR体系为：20μL的反应体系包含1xHotStarTaqbuffer，3.0mMol/LMg2+，0.3mMol/LdNTP，1UHotStarTaqpolymerase，1μL样本DNA和1μL多重PCR引物。可选的，所述提取绵羊基因组DNA，并将提取后的DNA溶于TE缓冲液中于-20℃保存的步骤还包括：进行PCR循环程序；所述进行PCR循环程序为：95℃，2min解链；94℃，20s，65℃，40s，72℃，1.5min，-0.5℃/cycle，共11cycles；94℃，20s，59℃，30s，72℃，1.5min，共24cycles；72℃，2min延伸。可选的，所述将所述PCR产物纯化，并设置延伸反应体系的步骤包括：在10μLPCR产物中加入5U虾碱酶SAP酶和2U外切酶ExonucleaseI酶，于37℃温浴1h后，于75℃灭活15min得到纯化后的PCR产物。可选的，所述将所述PCR产物纯化，并设置延伸反应体系的步骤还包括：设计单碱基延伸引物；所述单碱基延伸引物为：SNP29SF：TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGGTGAGTTGAGGAAGGAGCCSNP32SF：TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGGGTGGGCTGTTGTGGGGGSNP39SF：TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAAGGTGAGTTGAGGAAGGAGCCSNP41SR：CCCCTCAAGGTGCAACAATAGGSNP34SR：TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTACCAATTGAGTAAGGCTTCAAAGTTSNP35SF：TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCCTTGCCCAGGGAGAGGCASNP36SF：TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGGAAAGGCTCCCATCTCCTASNP42SF：TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGATGGCGGCAAACTTGTCCASNP46SF：TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCAACCAAGCCTATTGTGCAAA。可选的，所述将所述PCR产物纯化，并设置延伸反应体系的步骤，10μL延伸反应体系包括5μLSNaPshotMultiplexKit,2μL纯化后的多重PCR产物，1μL延伸引物混合物，2μL超纯水。可选的，所述将纯化后的PCR产物进行SNaPshot多重单碱基延伸反应得到纯化后的延伸产物步骤，其中SNaPshot多重单碱基延伸反应程序为96℃，1min解链；96℃，10s，55℃，5s，60℃，30s，共进行28cycles。可选的，所述根据所述延伸产物进行测序与单倍体分型步骤包括：取0.5μL纯化后的延伸产物与0.5μLLiz120SIZESTANDARD，9μLHi-Di混匀，95℃变性5min后上ABI3730XL测序仪，进行测序。由以上技术方案可知，本申请提供的一种绵羊H-FABP基因单倍型检测方法，包括以下步骤：根据绵羊H-FABP基因设计多重PCR引物；提取绵羊基因组DNA，并将提取后的DNA溶于TE缓冲液中于-20℃保存；PCR体系设置，通过多重反应得到PCR产物；将所述PCR产物纯化，并设置延伸反应体系；将纯化后的PCR产物进行SNaPshot多重单碱基延伸反应得到纯化后的延伸产物；根据所述延伸产物进行测序与单倍体分型。本申请提供的一种绵羊H-FABP基因单倍型检测方法，通过该方法可以自动检测绵羊H-FABP基因以上紧密连锁的5个位点，可以筛选优势单倍型BB型(GG/CC/GG/GG/AA)个体。附图说明为了更清楚地说明本申请的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。...

【技术保护点】
1.一种绵羊H-FABP基因单倍型检测方法，其特征在于，包括以下步骤：/n根据绵羊H-FABP基因设计多重PCR引物；/n提取绵羊基因组DNA，并将提取后的DNA溶于TE缓冲液中于-20℃保存；/n将提取后的绵羊基因组DNA与所述多重PCR引物加入PCR体系，通过多重反应得到PCR产物；/n将所述PCR产物纯化，并设置延伸反应体系；/n将纯化后的PCR产物在所述延伸反应体系进行SNaPshot多重单碱基延伸反应得到纯化后的延伸产物；/n根据所述延伸产物进行测序与单倍体分型。/n

【技术特征摘要】
1.一种绵羊H-FABP基因单倍型检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
根据绵羊H-FABP基因设计多重PCR引物；
提取绵羊基因组DNA，并将提取后的DNA溶于TE缓冲液中于-20℃保存；
将提取后的绵羊基因组DNA与所述多重PCR引物加入PCR体系，通过多重反应得到PCR产物；
将所述PCR产物纯化，并设置延伸反应体系；
将纯化后的PCR产物在所述延伸反应体系进行SNaPshot多重单碱基延伸反应得到纯化后的延伸产物；
根据所述延伸产物进行测序与单倍体分型。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述根据绵羊H-FABP基因设计多重PCR引物步骤中，所述PCR引物为：
SNP29_32F：GAGACCACGGCAGATGACAG
SNP29_32R：GACTCTTGCCTTTAGCACTTGG
SNP39_41F：GAAAGTTCTCACCCGCCTCTTCT
SNP39_41R：CTCCACAGGCAGGCTTCAATC
SNP34F：GAAATAGTTGACGGGAAACTCATTCT
SNP34R：AAAGCCCAAAGCCACGGTATTAC
SNP35_36F：CTGAAGGAGAGAGTGGTTGCAGAG
SNP35_36R：GAAAGGGCTGTGCTGTCAGGG
SNP42_46F：TCTTTCCACAGTCCATCGTGACAC
SNP42_46R：TTATGCAGAGGCGTGTACAAAGCC。


3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述提取绵羊基因组DNA，并将提取后的DNA溶于TE缓冲液中于-20℃保存的步骤还包括：DNA样本取1μL1％agarose电泳进行质量检查以及浓度预估，根据预估的浓度将样本稀释到工作浓度5-10ng/μL。


4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述PCR体系设置，通过多重反应得到PCR产物的步骤中所述PCR体系为：20μL的反应体系包含1xHotStarTaqbuffer，3.0mMol/LMg2+，0.3mMol/LdNTP，1UHotStarTaqpolymerase，1μL样本DNA和1μL多重PCR引物。


5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述提取绵羊基因组DNA，并将提取后的DNA溶于TE缓冲液中于-20℃保存的步骤还包括：进行PCR循环程序；所述进行PCR循环程序为：95℃，2min解链；94℃，20s，65℃，40s，72℃，1.5min，-0.5℃/cycle，共11cycles；94℃，20s，59℃，30s，72℃，1.5min，共24cycles；72℃，2min延伸。


6.根据权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：额尔和花，丁伟，岳彩娟，谢秀兰，马丽娜，马小明，王锦，王晓薇，施安，马吉峰，
申请(专利权)人：宁夏农林科学院动物科学研究所宁夏草畜工程技术研究中心，
类型：发明
国别省市：宁夏;64