一种miRNA的检测方法以及用于检测miRNA的侧流层析试纸条技术

本发明专利技术提供了一种miRNA的检测方法以及用于检测miRNA的侧流层析试纸条，涉及miRNA检测技术领域。所述方法包括：针对待检测的miRNA，设计合成互补DNA单链；基于所述miRNA与DNA单链形成DNA‑miRNA杂交复合物，采用免疫层析的方式进行检测。本发明专利技术提供了一种新的检测miRNA的方法，所述方法可以通过采用胶体金或荧光免疫层析等方式实现miRNA的快速检测。

【技术实现步骤摘要】
一种miRNA的检测方法以及用于检测miRNA的侧流层析试纸条
本专利技术涉及miRNA检测
，尤其是涉及一种miRNA的检测方法以及用于检测miRNA的侧流层析试纸条。
技术介绍
食品掺假已经成为当前食品安全的热点问题之一。2013年欧洲爆发的“马肉风波”，马肉被冒充牛肉进行销售，至此引发了全球对肉类掺假等食品欺诈现象的广泛关注。在我国，肉类掺假现象最为突出的是羊肉串掺假，这其中用鸭肉冒充羊肉是目前羊肉串掺假的主要手段。当前对羊肉串的掺假鉴别主要需要解决2方面问题：快速和定量。目前肉类掺假的鉴别方法主要有基于种属特异性肽段的质谱分析方法以及基于DNA的核酸检测方法。质谱方法准确可定量，但操作复杂时间长，只能在专业实验室完成，无法实现快速检测，且蛋白质的稳定性相对较差，受到高温、高压及各种化学试剂的影响，蛋白质的结构和性质会发生不同程度的改变，因此不适用于对深加工食品的检测。以各种PCR为主的核酸检测方法只能定性无法定量，同时由于PCR的高灵敏度无法实现对沾染和掺假两种情况的判别，此外较质谱分析方法，虽然核酸法的检测时间大为缩短，但仍需要1-2小时才能完成。因此上述方法无法满足市场监管、公安等部门现场快速准确检测的要求。鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的第一目的在于提供一种miRNA的检测方法。本专利技术的第二目的在于提供一种用于检测miRNA的侧流层析试纸条。本专利技术提供的技术方案如下：在一个方面，本专利技术提供了一种miRNA的检测方法，包括：针对待检测的miRNA，设计合成互补DNA单链；基于所述miRNA与DNA单链形成DNA-miRNA杂交复合物，采用免疫层析的方式进行检测。在一个实施方案中，所述免疫层析包括胶体金免疫层析和荧光免疫层析中的任一种；优选地，所述荧光免疫层析包括荧光素免疫层析和量子点免疫层析；更优选地，所述荧光免疫层析为荧光素免疫层析。在一个实施方案中，所述检测采用侧流层析试纸进行。在一个具体的实施方案中，将设计的荧光或胶体金标记好的生物素化DNA单链探针直接固定在试纸的结合垫上；所述试纸的检测线T线上包被有识别RNA-DNA杂交复合物的抗体，质控线C线上包被有链霉亲和素。在另一个具体实施方案中，将胶体金或荧光标记的S9.6抗体直接固定在试纸的结合垫上，所述试纸的检测线T线上包被有识别RNA-DNA杂交复合物的抗体，质控线C线上包被有抗鼠IgG。在一个实施方案中，采用胶体金试纸条/荧光试纸条进行检测。所述试纸条包括样品垫、结合垫、NC膜、底板、检测线T线、质控线C线和吸水垫。在一个实施方案中，所述试纸条的结合垫为胶体金标记的金标垫或者结合有荧光素标记物的结合垫。在一个实施方案中，所述试纸条的结合垫上含有胶体金/荧光材料标记的能与miRNA特异性结合的DNA探针或胶体金/荧光材料标记的能与miRNA-DNA复合物特异性结合的S9.6抗体。在一个实施方案中，所述胶体金标记物为纳米金。在一个实施方案中，所述识别RNA-DNA杂交复合物的抗体为小鼠单克隆抗体[S9.6]。S9.6抗体可有效识别用于研究RNA-DNA杂交复合物。该小鼠单克隆抗体针对ΦX174噬菌体衍生的合成DNA-RNA抗原产生，能够识别各种长度的RNA-DNA杂交体。所述识别RNA-DNA杂交复合物的抗体也可选择其他商用的单克隆抗体。在一个实施方案中，所述荧光素包括但不限于异硫氰酸荧光素、四乙基罗丹明、四甲基异硫氰酸罗丹明、荧光素Cy5中的任一种。在另一个实施方案中，使设计的DNA单链探针与所述miRNA形成杂交复合物后，采用免疫层析试纸的方式进行检测。当采用侧流层析试纸条进行检测时，当试纸条出现两条条带，一条位于质控区内，一条位于检测区，则结果为阳性，表明样本中含有待检测的miRNA；当试纸条只有质控区出现一条条带，检测区没有条带，则结果是阴性，表明样本中不含有待检测的miRNA。本专利技术还提供了一种用于检测miRNA的侧流层析试纸条，所述试纸条包括样品垫、结合垫、NC膜、底板、检测线T线、质控线C线和吸水垫。所述试纸条的结合垫上固定有针对待检测miRNA设计合成的胶体金或荧光标记的生物素化DNA单链探针或胶体金或荧光标记的S9.6抗体。在一个实施方案中，所述miRNA为种属特异性且稳定表达的miRNA；优选地，所述miRNA为羊肉和/或鸭肉的miRNA，其序列分别为SEQIDNo.1(5’-CACAAGUUAGGGUCUCAGGGA-3’)和SEQIDNo.2(5’-UUCUCUAGUGUAGUGGUUAUCACGUUC-3’)所示。在一个方面，本专利技术提供了一种肉类掺假的鉴别方法，包括：针对肉类种属特异性miRNA，设计合成互补DNA单链；基于所述miRNA与DNA单链形成DNA-miRNA杂交复合物，采用免疫层析的方式进行检测。在一个实施方案中，采用侧流层析试纸条进行检测时，当试纸条出现两条条带，一条位于质控区内，一条位于检测区，则结果为阳性，表明样本中含有肉类种属特异性miRNA；当试纸条只有质控区出现一条条带，检测区没有条带，则结果是阴性，表明样本中不含有肉类种属特异性miRNA。本专利技术通过针对筛选得到的生鲜熟制肉制品中均稳定表达的miRNA；设计互补DNA单链探针，利用其杂交形成DNA-RNA杂交体的特性，提供一种实现肉品中miRNA的检测，进而鉴别肉类掺假的方法。在一个实施方案中，所述方法还包括：(1)通过高通量RNAseq技术，分析肉类的miRNA表达谱；(2)筛选具有种属特异性且稳定表达的miRNA；优选地，所述肉类为生熟羊肉和/或生熟鸭肉。在一个优选的实施方案中，所述生熟羊肉的具有种属特异性且稳定表达的miRNA为5’-CACAAGUUAGGGUCUCAGGGA-3’(SEQIDNo.1)。在一个优选的实施方案中，所述生熟鸭肉的具有种属特异性且稳定表达的miRNA为5’-UUCUCUAGUGUAGUGGUUAUCACGUUC-3’(SEQIDNo.2)。在另一个方面，本专利技术还提供了一种用于检测肉类掺假的侧流层析试纸条，所述试纸条包括样品垫、结合垫、NC膜、底板、检测线T线、质控线C线和吸水垫，所述试纸条的结合垫上固定有针对肉类特异性miRNA设计合成的胶体金或荧光标记的生物素化DNA单链探针或胶体金或荧光标记的S9.6抗体。本专利技术借助于传统免疫层析方法通过肉品中miRNA的检测，开发了适用于现场快速检测的肉类掺假鉴别方法和侧流层析试纸条。在一个实施方案中，所述侧流层析试纸条的检测线T线上包被有识别RNA-DNA杂交复合物的抗体，所述质控线C线上包被有链霉亲和素或抗小鼠IgG。优选地，所述识别RNA-DNA杂交复合物的抗体为小鼠单克隆抗体[S9.6]。有益效果：本专利技术利用miRNA与DNA形成杂交复合物的特性，设计了一种新的miRNA的检测方法和一种用于检测m本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种miRNA的检测方法，其特征在于，包括：针对待检测的miRNA，设计合成互补DNA单链；基于所述miRNA与DNA单链形成DNA-miRNA杂交复合物，采用免疫层析的方式进行检测。/n

【技术特征摘要】
1.一种miRNA的检测方法，其特征在于，包括：针对待检测的miRNA，设计合成互补DNA单链；基于所述miRNA与DNA单链形成DNA-miRNA杂交复合物，采用免疫层析的方式进行检测。


2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述免疫层析包括胶体金免疫层析和荧光免疫层析中的任一种；
优选地，所述荧光免疫层析包括荧光素免疫层析和量子点免疫层析；更优选地，所述荧光免疫层析为荧光素免疫层析。


3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述检测采用侧流层析试纸进行。


4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，将设计合成的带有荧光素或胶体金标记的生物素化DNA单链直接固定在试纸的结合垫上，所述试纸的检测线T线上包被有识别RNA-DNA杂交复合物的抗体，质控线C线上包被有链霉亲和素。


5.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，将胶体金或荧光标记的S9.6抗体直接固定在试纸的结合垫上，所述试纸的检测线T线上包被有识别RNA-DNA杂交复合物的抗体，质控线C线上包被有抗鼠IgG。


6.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述识别RNA-DNA杂交复合物的抗体为小鼠单克隆抗体[S9.6]；
所述荧光素包括异硫...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈爱亮，王楠，张娟，谢瑞彬，于文杰，孙小云，
申请(专利权)人：中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11