高通量测序检测人源DNA的TCRB免疫组库的引物组和方法技术

本发明专利技术公开了一种基因高通量测序检测人源DNA的TCRB免疫组库的引物组和检测方法。引物组由多组合计36条引物组成，检测方法包括以下步骤：1以全血基因组或淋巴细胞基因组为模板，2采用2组引物分别进行多重PCR扩增，等体积混合后回收扩增产物；3回收产物通过接头连接法构建扩增子DNA文库，并回收文库；4通过高通量测序仪进行文库测序。本发明专利技术提供的引物组和检测方法并以此获得的高通量测序结果能应用于包括但不限于健康人群免疫状态评估、T淋巴细胞相关恶性肿瘤的MRD监测、干细胞移植术后监测等方面，具有灵敏度高、可重复性高，准确度高等优势。

【技术实现步骤摘要】
高通量测序检测人源DNA的TCRB免疫组库的引物组和方法
本专利技术涉及DNA测序
，具体涉及高通量测序检测人源DNA的TCRB免疫组库的引物组和方法。
技术介绍
T细胞受体(TCR)与抗原主要组织相容性复合体分子(MHC)相互作用介导抗原识别。TCR由两条肽链组成，其中95％由α链和β链，5％由γ链和δ链组成。每条肽链的互补决定区(尤其是CDR3)的多样性决定了抗原的特异结合的特异性和多样性，而其中TCRβ链的多样性表现最为丰富。TCRB基因的CDR3由三组片段组成：V/D/J片段，在细胞成熟过程中V/D/J片段会发生重组，同时在重组过程中伴随随机碱基的插入缺失等，最终形成大量的不同组合和长度的CDR3序列，构成复杂庞大的TCR(TCRB)免疫组库。随着癌症、自身免疫、炎症和传染病等疾病的发生和发展，TCR免疫组库结构会发生较大变化，即对TCRB免疫组库的研究能反馈个体免疫状态以及相关疾病的进展。TCR免疫组库检测可应用于疫苗和医药的研发、生物标志物的发现、T淋系疾病微小残留病检测、自身免疫性疾病的研究以及干细胞移植后监测等领域，具有良好的科研和临床应用价值。本项目建立以多重PCR和高通量测序技术为基础的检测DNA样本TCR(TCRB)的CDR3区域重组多态性的检测体系，提供临床科研服务及临床应用。因此，专利技术高通量测序检测人源DNA的TCRB免疫组库的引物组和方法很有必要。
技术实现思路
本专利技术的目的是建立以多重PCR和高通量测序技术为基础的检测DNA样本TCR(TCRB)的CDR3区域重组多态性的检测体系及其专用引物组。高通量测序检测人源DNA的TCRB免疫组库的引物组1由如下32条引物组成：引物1为表1的引物1所示的单链DNA分子；引物2为表1的引物2所示的单链DNA分子；引物3为表1的引物3所示的单链DNA分子；引物4为表1的引物4所示的单链DNA分子；引物5为表1的引物5所示的单链DNA分子；引物6为表1的引物6所示的单链DNA分子；引物7为表1的引物7所示的单链DNA分子；引物8为表1的引物8所示的单链DNA分子；引物9为表1的引物9所示的单链DNA分子；引物10为表1的引物10所示的单链DNA分子；引物11为表1的引物11所示的单链DNA分子；引物12为表1的引物12所示的单链DNA分子；引物13为表1的引物13所示的单链DNA分子；引物14为表1的引物14所示的单链DNA分子；引物15为表1的引物15所示的单链DNA分子；引物16为表1的引物16所示的单链DNA分子；引物17为表1的引物17所示的单链DNA分子；引物18为表1的引物18所示的单链DNA分子；引物19为表1的引物19所示的单链DNA分子；引物20为表1的引物20所示的单链DNA分子；引物21为表1的引物21所示的单链DNA分子；引物22为表1的引物22所示的单链DNA分子；引物23为表1的引物23所示的单链DNA分子；引物24为表1的引物24所示的单链DNA分子；引物25为表1的引物25所示的单链DNA分子；引物26为表1的引物26所示的单链DNA分子；引物27为表1的引物27所示的单链DNA分子；引物28为表1的引物28所示的单链DNA分子；引物29为表1的引物29所示的单链DNA分子；引物30为表1的引物30所示的单链DNA分子；引物31为表1的引物31所示的单链DNA分子；引物32为表1的引物32所示的单链DNA分子；引物组2，由如下27条引物组成：引物1为表2的引物1所示的单链DNA分子；引物2为表2的引物2所示的单链DNA分子；引物3为表2的引物3所示的单链DNA分子；引物4为表2的引物4所示的单链DNA分子；引物5为表2的引物5所示的单链DNA分子；引物6为表2的引物6所示的单链DNA分子；引物7为表2的引物7所示的单链DNA分子；引物8为表2的引物8所示的单链DNA分子；引物9为表2的引物9所示的单链DNA分子；引物10为表2的引物10所示的单链DNA分子；引物11为表2的引物11所示的单链DNA分子；引物12为表2的引物12所示的单链DNA分子；引物13为表2的引物13所示的单链DNA分子；引物14为表2的引物14所示的单链DNA分子；引物15为表2的引物15所示的单链DNA分子；引物16为表2的引物16所示的单链DNA分子；引物17为表2的引物17所示的单链DNA分子；引物18为表2的引物18所示的单链DNA分子；引物19为表2的引物19所示的单链DNA分子；引物20为表2的引物20所示的单链DNA分子；引物21为表2的引物21所示的单链DNA分子；引物22为表2的引物22所示的单链DNA分子；引物23为表2的引物23所示的单链DNA分子；引物33为表2的引物33所示的单链DNA分子；引物34为表2的引物34所示的单链DNA分子；引物35为表2的引物35所示的单链DNA分子；引物36为表2的引物36所示的单链DNA分子。高通量测序检测人源DNA的TCRB免疫组库的方法包括如下步骤：a)以待测样本的基因组DNA为模板，采用权利要求1所述引物组进行PCR扩增，等体积混合后回收扩增产物；b)以扩增产物为模板，采用连接法将测序接头连接到PCR产物两端，回收连接产物，即为DNA文库；c)将DNA文库进行高通量测序，获得TCRB免疫组库。附图说明图1为样本M06的CDR3长度分布，图2为样本M06的D基因长度分布，图3为样本M06的J基因利用率，图4为样本M06的V基因利用率，图5为样本M06的VJ基因利用率，图6为样本M07的CDR3长度分布，图7为样本M07的D基因长度分布，图8为样本M07的J基因利用率，图9为样本M07的V基因利用率，图10为样本M07的VJ基因利用率。具体实施方式用两组TCRB特异性引物进行多重PCR扩增获得TCRB基因CDR3区域，构建扩增子文库，在IlluminaNextSeq测序平台进行测序。对测序结果过滤后组装比对，并对组库结构以及多样性进行评估，对优势克隆进行追踪分析，具体步骤如下。1.TCRB引物组合与分孔方案引物组目标扩增区域包含人DNA中编码TCRβ链(TCRB)中的V区部分、整个D区和J区部分，引物母液使用TEBuffer(Invitrogen，货号12090015)进行稀释，母液浓度均为100uM，工作液中每条引物浓度2.5uM，工作液primerMix配置方案：每tube中各引物母液分别取1ul，最终使用ΜltraPureTMDNase/RNase-FreeDistilledWater(Invitrogen，货号10977-015)补足至40ul，最终形成TCRB-A/TCRB-B共计2个引物tubes。表1.TCRBtubeA引物序列表表2.tubeB引物序列表2.获取质量合格DNA样本DNA样本浓度要求大于45ng/ul，纯度要求260/280位于1.5到2.0之间，体积大于100ul；或DNA总量大本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.高通量测序检测人源DNA的TCRB免疫组库的引物组，其特征在于包括引物组1、引物组2，所述引物组1由如下32条引物组成：引物1为表1的引物1所示的单链DNA分子；引物2为表1的引物2所示的单链DNA分子；引物3为表1的引物3所示的单链DNA分子；引物4为表1的引物4所示的单链DNA分子；引物5为表1的引物5所示的单链DNA分子；引物6为表1的引物6所示的单链DNA分子；引物7为表1的引物7所示的单链DNA分子；引物8为表1的引物8所示的单链DNA分子；引物9为表1的引物9所示的单链DNA分子；引物10为表1的引物10所示的单链DNA分子；引物11为表1的引物11所示的单链DNA分子；引物12为表1的引物12所示的单链DNA分子；引物13为表1的引物13所示的单链DNA分子；引物14为表1的引物14所示的单链DNA分子；引物15为表1的引物15所示的单链DNA分子；引物16为表1的引物16所示的单链DNA分子；引物17为表1的引物17所示的单链DNA分子；引物18为表1的引物18所示的单链DNA分子；引物19为表1的引物19所示的单链DNA分子；引物20为表1的引物20所示的单链DNA分子；引物21为表1的引物21所示的单链DNA分子；引物22为表1的引物22所示的单链DNA分子；引物23为表1的引物23所示的单链DNA分子；引物24为表1的引物24所示的单链DNA分子；引物25为表1的引物25所示的单链DNA分子；引物26为表1的引物26所示的单链DNA分子；引物27为表1的引物27所示的单链DNA分子；引物28为表1的引物28所示的单链DNA分子；引物29为表1的引物29所示的单链DNA分子；引物30为表1的引物30所示的单链DNA分子；引物31为表1的引物31所示的单链DNA分子；引物32为表1的引物32所示的单链DNA分子；所述引物组2，由如下27条引物组成：引物1为表2的引物1所示的单链DNA分子；引物2为表2的引物2所示的单链DNA分子；引物3为表2的引物3所示的单链DNA分子；引物4为表2的引物4所示的单链DNA分子；引物5为表2的引物5所示的单链DNA分子；引物6为表2的引物6所示的单链DNA分子；引物7为表2的引物7所示的单链DNA分子；引物8为表2的引物8所示的单链DNA分子；引物9为表2的引物9所示的单链DNA分子；引物10为表2的引物10所示的单链DNA分子；引物11为表2的引物11所示的单链DNA分子；引物12为表2的引物12所示的单链DNA分子；引物13为表2的引物13所示的单链DNA分子；引物14为表2的引物14所示的单链DNA分子；引物15为表2的引物15所示的单链DNA分子；引物16为表2的引物16所示的单链DNA分子；引物17为表2的引物17所示的单链DNA分子；引物18为表2的引物18所示的单链DNA分子；引物19为表2的引物19所示的单链DNA分子；引物20为表2的引物20所示的单链DNA分子；引物21为表2的引物21所示的单链DNA分子；引物22为表2的引物22所示的单链DNA分子；引物23为表2的引物23所示的单链DNA分子；引物33为表2的引物33所示的单链DNA分子；引物34为表2的引物34所示的单链DNA分子；引物35为表2的引物35所示的单链DNA分子；引物36为表2的引物36所示的单链DNA分子。/n...

【技术特征摘要】
1.高通量测序检测人源DNA的TCRB免疫组库的引物组，其特征在于包括引物组1、引物组2，所述引物组1由如下32条引物组成：引物1为表1的引物1所示的单链DNA分子；引物2为表1的引物2所示的单链DNA分子；引物3为表1的引物3所示的单链DNA分子；引物4为表1的引物4所示的单链DNA分子；引物5为表1的引物5所示的单链DNA分子；引物6为表1的引物6所示的单链DNA分子；引物7为表1的引物7所示的单链DNA分子；引物8为表1的引物8所示的单链DNA分子；引物9为表1的引物9所示的单链DNA分子；引物10为表1的引物10所示的单链DNA分子；引物11为表1的引物11所示的单链DNA分子；引物12为表1的引物12所示的单链DNA分子；引物13为表1的引物13所示的单链DNA分子；引物14为表1的引物14所示的单链DNA分子；引物15为表1的引物15所示的单链DNA分子；引物16为表1的引物16所示的单链DNA分子；引物17为表1的引物17所示的单链DNA分子；引物18为表1的引物18所示的单链DNA分子；引物19为表1的引物19所示的单链DNA分子；引物20为表1的引物20所示的单链DNA分子；引物21为表1的引物21所示的单链DNA分子；引物22为表1的引物22所示的单链DNA分子；引物23为表1的引物23所示的单链DNA分子；引物24为表1的引物24所示的单链DNA分子；引物25为表1的引物25所示的单链DNA分子；引物26为表1的引物26所示的单链DNA分子；引物27为表1的引物27所示的单链DNA分子；引物28为表1的引物28所示的单链DNA分子；引物29为表1的引物29所示的单链DNA分子；引物30为表1的引物30所示的单链DNA分子；引物31为表1的引物31所示的单链DNA分子；引物32为表1的引物32所示的单链DNA分子；所述引物组2，由如下27条引物...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑仲征，方罡，李岱阳，徐祥，袁志阳，
申请(专利权)人：深圳荻硕贝肯精准医学有限公司，上海荻硕贝肯医学检验所有限公司，上海荻硕贝肯生物科技有限公司，上海荻硕贝肯基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44