一种免扩增核酸检测方法技术

本发明专利技术涉及一种免扩增核酸检测方法，该方法包括以下步骤：1)通过在金膜表面进行修饰得到的免扩增核酸检测传感芯片；2)以金纳米颗粒作为报告分子与待检测样品，加入所述免扩增核酸检测传感芯片的反应腔；3)通过波矢耦合搭建的具有无标记实时监测能力的表面等离子共振成像系统SPRi，实现对核酸的免扩增单颗粒检测。与现有技术相比，本发明专利技术通过对单分子杂交过程的动态检测和数字化分析，极大提高核酸检测的灵敏度，解决了核酸扩增易受气溶胶污染、假阳性高的问题。

【技术实现步骤摘要】
一种免扩增核酸检测方法
本专利技术属于生物传感器领域，涉及一种基于表面等离子共振显微成像技术的免扩增核酸检测方法。
技术介绍
分子诊断技术相较于其他技术具有快速、高灵敏、高特异性等优势，是体外诊断技术最重要的发展和研究方向。核酸检测作为分子诊断技术的一项重要应用发挥着越来越重要的作用，截至2020年12月3日，中国国家药品监督管理局已批准的53个新冠病毒检测试剂中就包含25个核酸检测试剂，可见核酸的单分子检测仍是目前应用最广，实用性最高的技术。如何提高核酸分子检测的速度、灵敏度和特异性，是提高重大疾病诊断能力的重点和难点问题。目前的核酸检测技术多采用靶标扩增(target-amplification)的策略来实现对待测核酸分子的超灵敏检测。其本质是一种终点检测，即将待测分子与试剂(酶，引物和底物等)充分反应后对扩增后的核酸分子进行信号检测，灵敏度和特异性均受分子结合动力学的限制。如图1所示，Ligand/Targetmolecule为配体目标分子，Receptor为受体，Non-specificbinding为非特异性结合的分子，specificbinding为特异性结合的分子，在分子杂交或免疫反应达到平衡状态时，发生结合的分子数取决于可结合位点数、样品浓度以及亲和力，因此当样品浓度降低到一定程度时，发生结合的分子数将不足1个，即使采用最先进的单分子检测技术，也将无法稳定检测到信号。该临界浓度即理论灵敏度极限，通常在100fM量级，同时由于背景噪声的存在无法达到单分子检测，导致在实际应用中的检测限通常在pM或pg/mL级，无法对更低丰度的重要生物分子进行检测。另一方面，虽然通常情况下特异性结合的亲和力要远高于非特异性结合，但在实际检测中，样品中干扰分子的浓度通常远高于待测分子，使得平衡状态下非特异性结合的分子数量变得不可忽略，造成假阳性结果。因此，在核酸检测中，首先需要采用聚合酶链式反应PCR技术进行核酸扩增，将样品浓度提高，通过荧光强度变化检测产物浓度的变化，这通常需要长时间的核酸提取和扩增步骤，如在新冠病毒检测中，核酸检测通常需要数个小时才能得到结果。从原理上来说，PCR技术并没有突破分子结合动力学的限制，也无法解决特异性的问题。最后，基于扩增策略还存在一个不容忽视的问题-气溶胶污染，PCR技术的高扩增效率产生的核酸气溶胶污染，会导致检测结果的假阳性，样本和扩增产物经常出现多批次相同的情况，核酸气溶胶污染在实验区域内不断累积，日积月累从而导致污染风险不断增加，假阳性的发生频率也越来越高。因此，开发一种无扩增的超灵敏的核酸检测装置成了分子诊断领域的一个迫切需要解决的问题。
技术实现思路
本专利技术的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种突破终点检测极限实现超灵敏检测，无需扩增，大大缩短检测时间且从根本上解决了气溶胶污染的免扩增核酸检测方法。本专利技术的目的可以通过以下技术方案来实现：一种免扩增核酸检测方法，该方法包括以下步骤：1)通过在金膜表面进行修饰得到的免扩增核酸检测传感芯片；2)以金纳米颗粒作为报告分子与待检测样品，加入所述免扩增核酸检测传感芯片的反应腔；3)通过波矢耦合搭建的具有无标记实时监测能力的表面等离子共振成像系统SPRi，实现对核酸的免扩增单颗粒检测。进一步地，所述的免扩增核酸检测传感芯片通过以下方法获得：a)在光学玻璃上利用磁控溅射法先镀3～9nm的铬Cr，再镀27～61nm的金Au，得到30～70nm厚度的镀膜表面；b)将步骤a)得到的镀有金膜的玻片用食人鱼洗液(体积比为7:3的H2SO4和H2O2混合溶液)冲洗吹干，接着用氢焰处理，除去表面颗粒杂质同时进一步提升金膜平整度；c)将步骤b)得到的芯片与微流控检测腔结合，并对芯片的金片表面进行修饰即得免扩增核酸检测传感芯片。进一步地，所述的微流控检测腔为带有孔的聚二甲基硅氧烷PDMS板，PDMS板上的预设孔即是反应检测腔室；芯片与微流控检测腔结合是将微流控检测腔固定在芯片的金片表面。进一步地，对芯片的金片表面进行修饰的方法如下：i)先在微流控检测腔的腔室加入浓度为10nM～100mM钝化分子，孵育30s～2min以钝化金表面，之后用1xPBS清洗三遍；ii)加入含有捕获分子的溶液，浓度为10nM～500nM，孵育2～8h；iii)孵育完成后移去溶液，用稀释20～100倍的PBS溶液清洗三遍，再用钝化分子孵育15～60min以减少非特异吸附；iv)用PBS清洗三遍以移除多余的化合物，所得芯片储存在4℃冰箱1～3月。所述的钝化分子为一段巯基修饰或进行了抑制非特异吸附的功能化的分子，如亲水化修饰，代表化合物巯基聚乙二醇(mPEG-SH),浓度在50nM～20mM；又如惰性修饰，代表化合物巯基乙醇(MCH)，浓度在100nM～10mM。钝化分子能有效抑制干扰分子和目标分子的非特异吸附，减少检测的假阳性。所述的捕获分子为长度x取值范围为17～150的ssDNA。表面修饰所用的捕获分子，若为巯基封端的单链DNA，需用10倍于捕获探针摩尔量的三(2-羧乙基)膦TCEP或二硫苏糖醇DTT溶液还原二硫键30min-1h，现配现用。所述的免扩增核酸检测传感芯片在检测过程中构建了类似ELISA的夹心(sandwich)结构的检测路径，实现单颗粒检测，其中：下方是修饰在免扩增核酸检测传感芯片金膜表面的捕获分子，为长度x，取值范围为17～150的ssDNA；金膜表面除了捕获分子外还有钝化分子用来抑制非特异性吸附，两者的比例在1：100～1:1000之间；中间是目标分子，是单链核酸ssDNA、微小核酸microRNA(miRNA)、信使RNA(mRNA、lncRNA)或循环核酸；上方是跟目标分子特异性结合的核酸作为检测分子，检测分子为ssDNA，其长度为y，取值范围为50～200；检测分子与报告分子紧密结合，通过报告分子实现对信号的放大，以实现对核酸的免扩增检测；本专利技术选用纳米颗粒代替荧光分子作为报告分子，其粒径在30～2000nm，材质为二氧化硅(硅球)、金(金球)、银(银颗粒)和聚苯乙烯PS等，纳米颗粒表面连接上检测分子，能有效提高单分子检测的效率。根据碰撞理论，分子间相遇的事件k，受到碰撞事件的频率Z，空间因素ρ和分子的活化能Eact。有公式：其中，R是气体常数，T是热力学温度。空间因素ρ受反应介质，空间位阻等影响，而分子的活化能在亲和力确定后只受温度影响。因此，为了提高单分子动态检测的效率，只能通过提高碰撞事件的频率Z，又有公式：其中，η为介质粘度，ra和rb分别代表两个分子的粒径，不妨设检测分子为ra，目标分子为rb。可知，纳米颗粒与检测分子连接在一起能有效提高检测分子的粒径，进而提高分子的碰撞事件概率和相遇事件k，意味着能显著提高单分子检测的效率，大大缩短检测时间。本专利技术所构建无扩增方法可以在10～20min内完成低至fM水平的核酸检测，与PCR技术的检测极本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种免扩增核酸检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：/n1)通过在金膜表面进行修饰得到的免扩增核酸检测传感芯片；/n2)以金纳米颗粒作为报告分子与待检测样品，加入所述免扩增核酸检测传感芯片的反应腔；/n3)通过波矢耦合搭建的具有无标记实时监测能力的表面等离子共振成像系统SPRi，实现对核酸的免扩增单颗粒检测。/n

【技术特征摘要】
1.一种免扩增核酸检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
1)通过在金膜表面进行修饰得到的免扩增核酸检测传感芯片；
2)以金纳米颗粒作为报告分子与待检测样品，加入所述免扩增核酸检测传感芯片的反应腔；
3)通过波矢耦合搭建的具有无标记实时监测能力的表面等离子共振成像系统SPRi，实现对核酸的免扩增单颗粒检测。


2.根据权利要求1所述的一种免扩增核酸检测方法，其特征在于，所述的免扩增核酸检测传感芯片通过以下方法获得：
a)在光学玻璃上利用磁控溅射法先镀3～9nm的铬Cr，再镀27～61nm的金Au，得到30～70nm厚度的镀膜表面；
b)将步骤a)得到的镀有金膜的玻片用食人鱼洗液冲洗吹干，接着用氢焰处理，除去表面颗粒杂质同时进一步提升金膜平整度；
c)将步骤b)得到的芯片与微流控检测腔结合，并对芯片的金片表面进行修饰即得免扩增核酸检测传感芯片。


3.根据权利要求2所述的一种免扩增核酸检测方法，其特征在于，所述的微流控检测腔为带有孔的聚二甲基硅氧烷PDMS板，PDMS板上的预设孔即是反应检测腔室；
芯片与微流控检测腔结合是将微流控检测腔固定在芯片的金片表面。


4.根据权利要求2所述的一种免扩增核酸检测方法，其特征在于，对芯片的金片表面进行修饰的方法如下：
i)先在微流控检测腔的腔室加入浓度为10nM～1uM钝化分子，孵育30s～2min钝化金表面，之后用1xPBS清洗；
ii)加入含有捕获分子的溶液，浓度为10nM～500nM，孵育2～8h；
iii)孵育完成后移去溶液，用稀释20～100倍的PBS溶液清洗，再用钝化分子孵育15～60min以减少非特异吸附；
iv)用PBS清洗以移除多余的化合物，所得芯片储存在4℃冰箱。


5.根据权利要求4所述的一种免扩增核酸检测方法，其特征在于，所述的钝化分子为一段巯基修饰或进行了抑制非特异吸附的功能化的分子，包括巯基聚乙二醇(mPEG-SH)、或巯基乙醇(MCH)；
所述的捕获分子为长度x取值范围为17～150的ssDNA。


6.根据权利要求1所述的一种免扩增核酸检测方法，其特征在于，所述的免扩增核酸检测传感芯片在检测过程中构建了夹心(sandwich)结构实现单颗粒检测，其中：<...

【专利技术属性】
技术研发人员：余辉，曾强，杨玉婷，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：上海;31