一种sHSPs重组侵入型植物乳杆菌活载体DNA疫苗制造技术

本发明专利技术的目的在于提供一种sHSPs重组侵入型植物乳杆菌活载体DNA疫苗，选择乳酸菌作为载体构建重组侵入型植物乳杆菌，植物乳杆菌具有免疫调节能力，携带肿瘤抗原具有抑制肿瘤生长作用，而旋毛虫sHSPs作为异种抗原可打破免疫耐受，产生显著的抗肿瘤免疫。使植物乳杆菌携带相关抗原基因sHSPs，既可发挥乳酸菌的非特异性免疫调节能力，又可以将sHSPs递送到宿主细胞表达出相关抗原sHSPs，诱导特异性免疫应答；携带旋毛虫sHSPs基因的重组植物乳杆菌既可发挥乳酸菌的非特异性免疫调节能力，又可诱导特异性抗肿瘤免疫。同时乳杆菌作为一种益生菌安全性高，可口服，使用便捷，易于推广。

【技术实现步骤摘要】
一种sHSPs重组侵入型植物乳杆菌活载体DNA疫苗
本专利技术公开了一种sHSPs重组侵入型植物乳杆菌活载DNA疫苗，是旋毛虫与Lewis肺癌相关抗原基因sHSPs重组侵入型植物乳杆菌活载体DNA疫苗，可用于Lewis肺癌的预防和治疗，属生物医药领域。
技术介绍
肺癌是死亡率最高的癌症，造成严重的经济负担。近年来，肺癌发病率日益上升且呈现年轻化趋势。目前肺癌尚无理想的防治疗法，开发新型疗法具有重要意义。疫苗分为治疗性疫苗和预防性疫苗，是防治疾病的重要手段。研发癌症疫苗是癌症研究的热点之一。近年来，研究发现细菌活载体疫苗可用于肿瘤防治，并表现出明显的疗效。其中，乳酸菌、双歧杆菌等益生菌对清除病原菌、维持肠道微生态平衡具有重要意义。某些乳酸菌可以调节免疫应答，具有抑制肿瘤生长的活性，并且重组乳酸菌活载体疫苗可以诱导特异性免疫反应。除此之外，乳酸菌活疫苗载体可口服，使用便捷、安全性高。旋毛虫是一种多细胞生物，人们发现感染旋毛虫能提高宿主的抗肿瘤能力。旋毛虫对乳腺癌、黑色素瘤、骨髓瘤等都具有明显的疗效。本专利技术涉及旋毛虫与Lewis肺癌相关抗原sHSPs抗血清可抑制Lewis肺癌细胞的增殖，并在动物实验上取得了71%的抑瘤率。以往重组乳酸菌肿瘤疫苗用的抗原是肿瘤自身抗原，易产生免疫耐受，难以诱导强有力的免疫应答，旋毛虫sHSPs是异源抗原可打破免疫耐受，诱导抗肿瘤免疫。同时，乳酸菌活载体疫苗安全有效，易储存和运输。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种sHSPs重组侵入型植物乳杆菌活载体DNA疫苗，利用旋毛虫与Lewis肺癌相关抗原基因sHSPs重组侵入型植物乳杆菌，可用于预防或治疗Lewis肺癌，还公开了该重组侵入型植物乳杆菌的制备方法。本专利技术所述的一种旋毛虫与Lewis肺癌相关抗原基因sHSPs，其序列如SEQno.1所示。本专利技术所述的一种重组植物乳杆菌递送质粒pValac-sHSPs，其特征在于是在质粒pValac上插入了序列如SEQno.1所示的sHSPs基因。本专利技术所述的一种sHSPs重组侵入型植物乳杆菌活载体DNA疫苗是转化了上述的一种重组质粒pValac-sHSPs的植物乳杆菌NC8（CCUG61730）活载体DNA疫苗。本专利技术所述的一种sHSPs重组侵入型植物乳杆菌的制备方法，包括以下步骤：sHSPs基因的扩增：根据旋毛虫sHSPs基因DNA序列（DQ986457.1）和穿梭载体pValac载体图谱设计引物：上游引物：5'-GGATCCGCCACCATGGACTACAAAGACGATGACGACAAAATGGCCTTGACTGCGTGGTATAAT-3'，其中5’端的酶切为BamHⅠ；下游引物：5'CTCGAGTTAATGGTGATGGTGGTGATGTCTCTTCTGAGCAGCCGGAGCG-3'，其中5’端的酶切为XhoⅠ；PCR扩增旋毛虫sHSPs基因，胶回收后克隆至pMD18-T载体并进行菌液PCR、测序鉴定并命名为pMD18-T-sHSPs；sHSPs重组侵入型植物乳杆菌的构建：用BamHⅠ、XhoⅠ分别酶切、回收并连接sHSPs与pValac，转化E.coliTG-1感受态细胞，命名为pValac-sHSPs；重组质粒pValac-sHSPs转染293T细胞鉴定表达后，转化植物乳杆菌感受态NC8（CCUG61730），通过Cm+（10μg/mL）筛选阳性克隆，命名为NC8-sHSPs。本专利技术制备的一种sHSPs重组侵入型植物乳杆菌在制备抗Lewis肺癌药物中的应用。重组侵入型植物乳杆菌NC8-sHSPs对Lewis肺癌的预防效果重组植物乳杆菌NC8-sHSPs以109CFU/只的剂量经口免疫C57BL/6小鼠，共免疫2次，二免疫后7天，小鼠皮下接种Lewis肺癌细胞荷瘤，荷瘤后第14天，处死小鼠，计算抑瘤率，通过检测体液免疫、细胞免疫、黏膜免疫等评价抗肿瘤效果，通过组织器官HE染色检测病理组织学损伤。重组侵入型植物乳杆菌NC8-sHSPs对Lewis肺癌的治疗效果C57BL/6小鼠皮下接种LLC细胞荷瘤，可触摸到肿瘤后，连续使用109CFU重组植物乳杆菌NC8-sHSPs灌胃治疗15天。治疗结束，处死小鼠，计算抑瘤率和小鼠生存率，通过检测体液免疫、细胞免疫、黏膜免疫等评价抗肿瘤效果，通过组织器官HE染色检测病理组织学损伤。本专利技术制备的重组植物乳杆菌NC8-sHSPs预防和治疗均可通过激活体液免疫、细胞免疫、黏膜免疫抑制Lewis肺癌生长。本专利技术的积极效果在于：本专利技术选择乳酸菌作为载体构建重组侵入型植物乳杆菌，植物乳杆菌具有免疫调节能力，携带肿瘤抗原具有抑制肿瘤生长作用，而旋毛虫sHSPs作为异种抗原可打破免疫耐受，产生显著的抗肿瘤免疫。使植物乳杆菌携带相关抗原基因sHSPs，既可发挥乳酸菌的非特异性免疫调节能力，又可以将sHSPs递送到宿主细胞表达出相关抗原sHSPs，诱导特异性免疫应答；携带旋毛虫sHSPs基因的重组植物乳杆菌既可发挥乳酸菌的非特异性免疫调节能力，又可诱导特异性抗肿瘤免疫。同时乳杆菌作为一种益生菌安全性高，可口服，使用便捷，易于推广。附图说明：图1为本专利技术重组质粒pValac-sHSPs在293T细胞内表达鉴定（1：未处理细胞；2：转染pValac；3：转染pValac-sHSPs）；图2为专利技术重组植物乳杆菌NC8-sHSPs在小肠内定植检测；图3为专利技术预防组肿瘤组织图片；图4为专利技术预防组血清sHSPs特异性抗体水平；图5为专利技术预防组组织器官HE染色图；图6为专利技术治疗组肿瘤组织图片；图7为专利技术治疗组血清sHSPs特异性抗体水平；图8为专利技术治疗组小鼠生存率；图9为专利技术治疗组组织器官HE染色图。具体实施方式通过以下实施例进一步举例描述本专利技术，并不以任何方式限制本专利技术，在不背离本专利技术的技术解决方案的前提下，对本专利技术所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本专利技术的权利要求范围之内。实施例1sHSPs基因的扩增：根据旋毛虫sHSPs基因DNA序列设计引物：上游引物：5'-GGATCCGCCACCATGGACTACAAAGACGATGACGACAAAATGGCCTTGACTGCGTGGTATAAT-3'，下游引物：5'CTCGAGTTAATGGTGATGGTGGTGATGTCTCTTCTGAGCAGCCGGAGCG-3'；酶切位点分别为：GGATCC(BamHⅠ)；CTCGAG(XhoⅠ)；上游引物中加粗为Kozak序列，下划线为Flag序列；下游引物中加粗为终止密码子序列，下划线为His序列；PCR扩增旋毛虫sHSPs基因，胶回收后克隆至pMD18-T载体并进行菌液PCR、测序鉴定并命名为pMD18-T-sHSPs。实施例2s本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种旋毛虫与Lewis肺癌相关抗原基因sHSPs，其序列如SEQ no.1所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种旋毛虫与Lewis肺癌相关抗原基因sHSPs，其序列如SEQno.1所示。


2.一种重组pValac-sHSPs的植物乳杆菌递送质粒，其特征在于是在质粒pValac上插入了序列如SEQno.1所示的sHSPs基因。


3.一种sHSPs重组侵入型植物乳杆菌活载体疫苗是转化了权利要求2所述的一种重组pValac-sHSPs的植物乳杆菌递送质粒的植物乳杆菌NC8（CCUG61730）的疫苗。


4.一种sHSPs重组侵入型植物乳杆菌的制备方法，包括以下步骤：
sHSPs基因的扩增：
根据旋毛虫sHSPs基因DNA序列（DQ986457.1）和穿梭载体pValac载体图谱设计引物：
上游引物：
5'-GGATCCGCCACCATGGACTACAAAGACGATGACGACAAAATGGCCTTGACTGCGTGGTATAAT-3'...

【专利技术属性】
技术研发人员：张西臣，岳涛涛，张楠，宫鹏涛，李建华，刘少雄，王晓岑，李新，程淑琴，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：吉林;22