一种靶向CD206阳性细胞的核酸适体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种靶向CD206阳性细胞的核酸适体及其作为药物载体、检测试剂盒和分子探针等方面的应用。该核酸适体可与CCL18siRNA结合形成靶向CD206阳性细胞的抗肿瘤嵌合体，可明显抑制CCL18细胞因子的合成和分泌，大幅度降低乳腺癌细胞的迁移侵袭能力，为晚期乳腺癌提供新的治疗途径。本发明专利技术的核酸适体及其嵌合体具有优良的特异靶向性和亲和性，安全高效；可通过人工合成，规模化生产。

【技术实现步骤摘要】
一种靶向CD206阳性细胞的核酸适体及其应用
本专利技术涉及生物医药领域的生物分子药物载体技术，具体涉及一种靶向CD206阳性细胞的核酸适体及其应用。
技术介绍
RNA干预(RNAi)是抑制基因表达的强大武器。AndrewZ.Fire和CraigC.Mello两位科学家于1998年报道发现了核糖核酸干扰(RibonucleicAcidInterference,RNAi)现象，并于2006年获得诺贝尔医学奖。2001年，Tuchl等把长度约为19-23碱基对、人工合成的外源性沉默RNA(siRNA)导入哺乳动物细胞内，能诱导出特异地抑制互补序列基因表达的RNAi效应。随后通过RNA干预抑制致病基因的表达，开拓出治疗包括恶性肿瘤在内的多种新型基因药物。与传统的抑制基因表达工具反义寡核苷酸和核糖酶比较，siRNA沉默基因表达的效应要强大数十倍至数百倍。siRNA沉默基因干扰治疗疾病的关键在于：一、发现治疗靶点；二、找到靶向输送载体。以乳腺癌为例，研究发现，在乳腺癌的微环境中，肿瘤相关巨噬细胞(以下简称“TAMs”)以及其分泌的细胞因子CCL18对肿瘤细胞的浸润转移有十分重要的作用。细胞因子CCL18是C-C膜体细胞因子受体家族的一员，TAMs分泌的CCL18因子可以通过激活PI3K/Akt通路诱导乳腺癌细胞的EMT从而促进乳腺癌细胞的侵袭与转移。和肿瘤相关巨噬细胞与乳腺癌细胞之间存在一种正反馈作用，它表现在肿瘤相关巨噬细胞可以分泌CCL18诱导乳腺癌细胞发生上皮-间充质转化(EMT)、加强后者侵袭和远处转移的能力；而乳腺癌细胞则同时大量分泌GM-CSF促进肿瘤相关巨噬细胞继续分泌更多CCL18；这种正向促进作用可通过抑制CCL18因子的分泌被打破。肿瘤相关巨噬细胞不仅在乳腺癌，甚至在更多的实体恶性肿瘤相关文献报道中也被发现具有促肿瘤的作用。因此肿瘤相关巨噬细胞可作为治疗乳腺癌的一个重要靶标，甚至可发展为治疗多种实体恶性肿瘤的共同靶标。CD206也叫甘露糖受体，是一类主要表达在巨噬细胞和树突状细胞的细胞膜表面，尤其在肿瘤相关巨噬细胞表面高表达、具有识别病原体、递呈抗原和保持内环境稳定的受体蛋白，属于C型凝集素超家族成员。以CD206作为靶向肿瘤相关巨噬细胞的靶点是可行的尝试。在体外细胞培养或裸鼠移植肿瘤模型的实验中，有文献报道应用RNAi成功地抑制了癌基因如k-ras和cyclinE的表达，肿瘤抗凋亡基因BCL-2的表达和肿瘤耐药基因mdr1的表达，并有效地减少了癌细胞增殖，增加了其对化疗药物的敏感性。沉默Her2基因表达的RNAi也成功地抑制体外培养的乳腺癌细胞增殖。这些初步的实验充分证明了武装RNAi成为新一代抗肿瘤药物的潜力很大。但是，目前RNAi抗肿瘤的实验研究都是在体外培养的肿瘤细胞中直接转染或转导RNAi或在裸鼠移植肿瘤组织内直接注入RNAi，虽然这些实验获得一定的成功，但是距离在临床上真正使用RNAi治疗肿瘤还相差很远。目前，RNAi应用的主要障碍在于如何在临床应用时把特异的RNAi导入目标细胞胞浆内起作用，特别是导入过量表达目标基因的肿瘤细胞内。输送载体是RNA干预的关键所在。较常见的小分子RNA载体有：1.蛋白类主要包括抗体及其片段和短肽和多肽，如抗体偶联siRNA递送体统。偶联siRNA分子的蛋白分子如抗体在与细胞或靶器官表面抗原分子结合时进入细胞从而使siRNA发挥基因干扰作用。此递药系统的优势是通过抗原抗体分子结合的方式，具有结合特异性，但存在抗原非特异性，大分子蛋白在机体内的免疫原性及内环境屏障的透过率导致药物消耗及毒副反应，以及生产的特殊性导致费用高昂。2.纳米材料目前递药系统研究的一大热点即纳米材料，高分子纳米材料可通过物理化学性质被动或主动靶向肿瘤组织递送药物，相对蛋白类更容易穿过生理屏障被吸收，毒副作用相对较少，现也有研究可控释放的纳米材料，具有更安全可控的递药效果，但目前纳米材料的研究仍存在稳定因素及生物安全因素，且费用较高。3.核酸类主要指核酸适配体或核酸适体(aptamer)，这是一类小片段的单链寡聚核苷酸，长度一般在200个碱基以内，可通过自身的序列特点自然折叠形成的空间结构，从而与特定的分子具有高度的结合能力。这种核酸片段在自然界中存在，同时也可以通过指数富集配体系统进化技术(SELEX)筛选得到。因其分子量很小，易通过结合靶蛋白内化进入细胞，这也使其具有双重作用，既可识别，还有协助药物内化，并且这类小分子核酸片段筛选出来后很容易得到，合成较简单快速，易于进行化学修饰和多功能化，组织穿透性好，免疫原性也更小，具有较少的毒副反应。如何筛选获得靶向性能好，又可与siRNA药物完美结合，协助药物内化的适配体，是目前siRNA分子靶向治疗药物有待解决的技术难题。
技术实现思路
由此，本专利技术提供了一种靶向CD206阳性细胞的核酸适体，其序列包括如下序列：5′-TAAGGCTTACTATTTTGGTGTGCAGTATGAGCGAGCGTTGCGA-3′。该核酸适体优选图1所示的两种空间二级结构。所述的CD206阳性细胞包括巨噬细胞或树突状细胞。基于本核酸适体的靶向特异性，本专利技术进一步公开其在制备检测CD206阳性细胞的试剂盒、分子探针及靶向药物载体方面的应用。并进一步公开由上述核酸适体搭载小分子RNA药物所形成，靶向CD206阳性细胞的嵌合体；及其在制备抗肿瘤药物中的应用。同时，公开一种抑制细胞因子CCL18分泌合成的嵌合体及其在制备抗乳腺癌药物中的应用。该嵌合体由核酸适体搭载CCL18siRNA结合而成。其序列为：5′-TAAGGCTTACTATTTTGGTGTGCAGTATGAGCGAGCGTTGCGAACAAGUUGGUACCAACAAATTUUUGUUGGUACCAACUUGUGC-3′。该嵌合体在应用中优选图2所示的三种空间二级结构。所述嵌合体的制备方法，包括如下步骤：1、合成核酸适体，连接RNA正义链的中间体以及RNA反义链；2、将相同浓度的中间体和RNA反义链混合，加入退火缓冲液，在90℃水浴锅中缓慢退火至25℃，得目标物。经实验证明：本专利技术的核酸适体可精准识别CD206阳性细胞，具有优良的特异靶向性和亲和性；可作为检测CD206阳性细胞的试剂盒、分子探针和靶向药物载体。该核酸适体具有特定的空间结构及适当的分子量，可有效搭载siRNA等小分子RNA药物到达靶点细胞内部精准高效发挥药效。特别是与CCL18siRNA结合的嵌合体，可明显抑制CCL18细胞因子的合成和分泌，大幅度降低乳腺癌细胞迁移侵袭能力，为晚期乳腺癌提供新的治疗途径。该核酸适体是非病毒载体，有助于加速RNAi技术在临床上的应用，生物安全性高，且可通过人工合成，合成工艺简单，可规模化生产。附图说明图1是本专利技术实施例核酸适体的二级结构图；图2是本专利技术实施例嵌合体的二级结构图；图3是本专利技术实施例嵌合体退火合成示意图；<本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种靶向CD206阳性细胞的核酸适体，其特征在于，其序列包括如下序列：5′-TAAGGCTTACTATTTTGGTGTGCAGTATGAGCGAGCGTTGCGA-3′。/n

【技术特征摘要】
1.一种靶向CD206阳性细胞的核酸适体，其特征在于，其序列包括如下序列：5′-TAAGGCTTACTATTTTGGTGTGCAGTATGAGCGAGCGTTGCGA-3′。


2.如权利要求1所述的核酸适体，其特征在于，所述核酸适体的二级结构包括如图1所示的两种结构。


3.如权利要求1或2所述的核酸适体，其特征在于，所述的CD206阳性细胞包括CD206阳性巨噬细胞或树突状细胞。


4.权利要求1或2所述的核酸适体在制备检测CD206阳性细胞试剂盒或分子探针或靶向药物载体中的应用。


5.一种靶向CD206阳性细胞的嵌合体，其特征在于，所述嵌合体是由权利要求1或2或3所述的核酸适体和小分子RNA药物结合而成的核酸序列组合。


6.如权利要求5所述的嵌合体，其特征在于，所述RNA为CCL18siRNA，其序列为5′-ACAAGUUGGUA...

【专利技术属性】
技术研发人员：姚燕丹，宋尔卫，张明霞，
申请(专利权)人：中山大学孙逸仙纪念医院，
类型：发明
国别省市：广东;44