本发明专利技术公开了一种Aspergillusoryzae绝对定量的引物、探针及试剂盒，属于生物领域、食品领域、检测领域。本发明专利技术通过大量的筛选获得了Aspergillusoryzae特异性片段，并将其用于信号探针试剂和淬灭探针的构建，设计得到了Aspergillusoryzae定量探针和试剂盒。本发明专利技术能够实现Aspergillusoryzae的总量检测，用于检测和Aspergillusoryzae定量时不需要使用昂贵仪器，可在2.5h内快速完成定量工作。同时，本发明专利技术所使用的样品不必须进行核酸提取。基于本发明专利技术的探针、检测试剂盒用于Aspergillusoryzae定量，具有快速、方便、便宜、准确的特点。
【技术实现步骤摘要】
一种Aspergillusoryzae绝对定量的引物、探针及试剂盒
本专利技术涉及一种Aspergillusoryzae绝对定量的引物、探针及试剂盒，属于生物领域、食品领域、检测领域。
技术介绍
Aspergillusoryzae广泛存在于食品中，尤其是传统发酵食品，参与发酵过程中的生物反应过程包括白酒、普洱茶等。例如在白酒发酵过程中，Aspergillusoryzae可以分泌多种淀粉酶、蛋白酶，作用于淀粉和蛋白的水解，对乙醇以及风味成分的代谢至关重要。因此实时有必要跟踪Aspergillusoryzae的生物量，对判断发酵批次稳定性以及发酵参数调控具有重要的指导意义。但目前传统发酵食品体系多数是多菌种共发酵体系，通过简单的OD比色法无法判断样本中Aspergillusoryzae的含量，虽然荧光定量PCR法结合特异性引物或探针可以实现混菌系统中Aspergillusoryzae的定量，但是需要高额的设备和高要求的操作环境。因此，为方便、快速、准确地跟踪样本中Aspergillusoryzae的生长变化趋势，有必要开发相应的Aspergillusoryzae定量方法以及试剂盒。G四链体/血红素模拟酶活检测的原理在于G四链体可以与血红素形成具有过氧化氢酶活性的DNA模拟酶，可催化过氧化氢氧化ABTS生成ABTS+，呈现绿色的显色反应，可在波长420nm下检测特征吸光值。G四链体结构的稳定性对整个检测过程至关重要，如果设计不当，当G四链体序列与其他碱基形成二聚体时，会导致G四链体序列无法形成G四链体，以此原理为基础的定量方法在使用中会导致低估样本中目标基因的含量，降低检测方法的灵敏度和准确性。目前，专利技术人团队在前期研究中已针对Pichiakudriavzevii、Lactobacillusacetotolerans、Lactobacillusjinshani、Zygosaccharomycesbailii、Aspergillustubingensis、Schizosaccharomycespombe设计了基于G四链体/血红素模拟酶活性检测原理的微生物定量方法，但是针对Aspergillusoryzae的定量方法尚未被开发。其中困难性主要体现在两个方面：①无可用特异性序列用于区分目标物种和其他进化关系相近的物种；②Aspergillusoryzae在菌株的种类上存在多样性，目前NCBI已报道105个菌株，在种间特异性序列寻找中，如何保证序列在种内的覆盖度，是开发具有普适性Aspergillusoryzae定量方法的关键。
技术实现思路
本专利技术的一种用于Aspergillusoryzae绝对定量的探针、试剂盒及应用，解决了如下的至少一个技术问题：(1)目前不存在已报道的Aspergillusoryzae的特异性序列；(2)现有的方法无法实现所有Aspergillusoryzae的总量检测；(3)现有定量方法在物种分辨率较低和/或检测准确性不足；(4)现有定量方法需要高额的仪器设备和/或严格的操作环境，不适用于生产采样后的及时检测；(5)现有定量方法操作繁琐等。本专利技术的第一个目的是提供一组引物对，包括SEQIDNO.5和SEQIDNO.6。基于该引物对，设计了种间高特异性、种内高覆盖度的探针，包括信号探针和淬灭探针；信号探针序列为SEQIDNO.1所示(GGGTGGGTGGGTGGGTCCTCGGTTGGTCTGA)。在一种实施方式中，淬灭探针序列为SEQIDNO.2所示(TCAGACCAACCGAGGACCCA)。本专利技术的第二个目的是提供Aspergillusoryzae定量方法，所述方法包括使用本专利技术的引物对或探针。所述方法包括：待测样品中DNA发生解链；加入过量信号探针(序列如SEQIDNO.1)，与待测样本的目标核苷酸片段结合形成双链，使G四链体裸漏在序列之外；加入足量淬灭探针(序列如SEQIDNO.2)与未结合的信号探针形成双链，破坏G四链体结构；利用裸漏在外G四链体与血红素反应形成具有过氧化氢酶活性的G四链体/血红素模拟酶，结合过氧化氢酶的活性表征Aspergillusoryzae的生物量。在一种实施方式中，所述方法为绝对定量方法，还包括：建立过氧化氢酶活性(或者与过氧化氢酶活性呈相关性的指标，比如催化过氧化氢氧化ABTS生成ABTS+后溶液在波长420nm下的吸光值)与Aspergillusoryzae的生物量的标准曲线；检测待测样品时，将检测到的过氧化氢酶活性代入标准曲线，即获得待测样品中的Aspergillusoryzae的生物量。在一种实施方式中，所述方法为相对定量方法，还包括：检测多个样品，根据不同样本检测得到的过氧化氢酶活性的相对比值确定该多个不同样本中Aspergillusoryzae的生物量的相对值。在一种实施方式中，所述待测样品为含有菌体、基因组或宏基因组等的样品。可选地，所述待测样品为食品成品或者取自食品生产过程中的样品；可选地，待测样本进行离心、收集菌体等预处理后再进行后续测定。优选地，收集该样品中的菌体后不经基因组提取，直接进行DNA解链处理。在一种实施方式中，所述样品为食品或者取自食品生产过程中的样品或环境样本。在一种实施方式中，所述食品为以下任意一种以上：白酒、黄酒、酱油、啤酒、葡萄酒、食醋、发酵茶、传统发酵蔬菜、发酵饮料、酒精饮品、酸奶、干酪、果醋、酒酿、豆豉、乳腐、发酵米面食品、蜜饯、水产品、饮料、糖果、饼干、方便面等；所述环境样本选自肠道、土壤、水体等。在一种实施方式中，所述待测样品中DNA发生解链，是采用高温方式进行。可选地，是将待测样品在高于90℃温度下处理。可以是金属浴、水浴、烘箱、保温仪等任意一种能提供对应温度的环境。在一种实施方式中，所述解链是在缓冲液中进行。可选地，所述缓冲液可以是Tris-HCl缓冲液，还含有KCl、NH4Cl、NaCl中的任意一种或者多种。可选地，所述缓冲液为Tris-HCl，KCl，pH＝7.9。在一种实施方式中，所述过量是指，加入量高于能与待测样本的目标核苷酸片段全部结合形成双链时所需要的信号探针的量。具体用量，本领域技术人员可以结合本领域常识或具体的待测样本来确定，或者通过预实验来确定。在一种实施方式中，所述过量是指，超过1010个拷贝的信号探针。在一种实施方式中，所述信号探针与待测样本的目标核苷酸片段结合形成双链，是在50-60℃温度范围下进行的。在一种实施方式中，所述足量是指，加入量足以与全部未结合的信号探针形成双链时所需要的淬灭探针的量。具体用量，本领域技术人员可以结合本领域常识来确定或具体的待测样本来确定，或者通过预实验来确定。在一种实施方式中，所述足量是指，信号探针的双倍量。在一种实施方式中，所述加入足量淬灭探针与未结合的信号探针形成双链，是在能使淬灭探针与未结合的信号探针形成双链的温度下进行；本领域技术人员可以结合本领域常识来确定或具体的待测样本来确定。在一种实施方式中，所述利用裸漏本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一组引物对，其特征在于，所述引物对的序列包括SEQ ID NO.5所示序列、SEQ IDNO.6所示序列。/n
【技术特征摘要】
1.一组引物对，其特征在于，所述引物对的序列包括SEQIDNO.5所示序列、SEQIDNO.6所示序列。
2.一组探针，其特征在于，包括信号探针和淬灭探针；信号探针序列包括SEQIDNO.1所示序列；淬灭探针序列包括SEQIDNO.2所示的序列。
3.检测试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述的引物对，或者权利要求2所述的信号探针和淬灭探针。
4.根据权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒中含有权利要求2所述的信号探针和淬灭探针，还含有如下任意一种或多种：血红素、缓冲液、2,2-连氮基-双-(3-乙基苯并二氢噻唑啉-6-磺酸)二铵盐、H2O2。
5.一种Aspergillusoryzae定量方法，其特征在于，所述方法使用了权利要求1所述的引物对，或者权利要求2所述的探针，或者权利要求3-4任一所述的检测试剂盒。
6.根据权利要求5所述的定量方法，其特征在于，所述方法包括：待测样品中DNA发生解链；加入过量信号探针，与待测样本的目标核苷酸片段结合形成双链，使G四链体裸漏在序列之外；加入足量淬灭探针与未结合的信号探针形成双链，破坏G四链体结构；利用裸漏在外G四链体与血红素反应形成具有过氧化氢酶活性的G四链体/血红素模拟酶，结合过氧...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴群，徐岩，杜如冰，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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