从白酒大曲或酒醅中提取微生物总DNA的方法及用途技术

本发明专利技术属于分子生物学技术领域，具体涉及从白酒大曲或酒醅中提取微生物总DNA的方法及用途。本发明专利技术所解决的技术问题是针对白酒大曲或酒醅微生物中DNA提取困难的现状，提供一种通过物理法、酶法和试剂盒法联用提高微生物总DNA提取质量的方法。本发明专利技术的方法中试剂易于获取，操作方法也较为简单，利用酶、物理相结合的方法破壁，得到的真菌及细菌的基因组DNA较为完整，纯度也高，提取质量稳定。本发明专利技术的方法不仅适用于大曲微生物总DNA的提取，对于提取酒醅微生物总DNA也有较好的效果。

【技术实现步骤摘要】
从白酒大曲或酒醅中提取微生物总DNA的方法及用途
本专利技术属于分子生物学
，具体涉及从白酒大曲或酒醅中提取微生物总DNA的方法及用途。
技术介绍
中国白酒酿造历史悠久，因其独特的口感深受大众喜爱，具有较高的经济价值。根据白酒风味特征的不同，可以将其分为三种主要类型：浓香型白酒、酱香型白酒和清香型白酒。白酒的酿造采用了传统固态糖化发酵工艺，大曲是酿造浓香型白酒的关键，它富含微生物、酶与香味代谢物，不仅是白酒酿造的重要物质基础，也为制酒过程提供糖化发酵，生香的酶源及香味前体物质。但开放的制曲方式造成了制曲的原材料、环境、工具等方面都有可能带入微生物，这使得大曲的微生物来源十分广泛，这些不稳定因素将会导致大曲品质的波动性，最终影响白酒品质与产量的稳定性。因此研究大曲中微生物群落结构对稳定和改善白酒品质显得尤为重要。随着测序技术、组学技术、分子生物学技术的不断进步发展，大曲中混菌发酵体系的研究有了必要的技术保障。目前对大曲微生物的研究还主要集中在通过可培养法对大曲中可培养微生物的研究分析，但传统的可培养法，能培养的微生物种类是有限的，大部分的不可培养微生物难以被发现，得到的微生物群不能准确的代表整个大曲的微生物群落组成。应用分子生物学的方法，能有效地克服传统可培养技术的不足，扩增子测序能更加快速准确的得到大曲微生物组成，宏基因组学还能对群落中微生物的潜在功能进行预测。但是，无论是扩增子测序还是宏基因组测序，都需要先从大曲样品中获得微生物总DNA，微生物总DNA的质量决定了测序结果的准确性。然而，因为大曲样品中复杂的成分，对微生物总DNA的提取造成了一定的难度。目前对于微生物总DNA的提取的方法主要是化学法和试剂盒法，但化学法提取的基因组片段较小，且纯度低，试剂盒法提取的基因组浓度则较低，因此急需要一种能提取出完整性较好、纯度和浓度高的基因组的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对白酒大曲和酒醅微生物中DNA提取困难的现状，提供一种通过物理法、酶法和试剂盒法联用提高微生物总DNA提取质量的方法，为分析白酒大曲和酒醅样品中微生物群落多样性奠定基础。本专利技术提供了从白酒大曲或酒醅中提取微生物总DNA的方法，包括以下步骤：从白酒大曲或酒醅中收集菌体，反复冻融后加酶反应，然后使用试剂盒提取微生物总DNA。其中，上述从白酒大曲或酒醅中提取微生物总DNA的方法，包括以下步骤：a、白酒大曲或酒醅中加PBS缓冲液震荡、离心后，收集上清液；重复前述步骤，合并上清液；b、将收集的上清液离心后，收集菌体沉淀；c、将菌体沉淀重悬于PBS缓冲液中，得菌体重悬液；d、将菌体重悬液反复冻融后加酶反应，然后使用试剂盒提取微生物总DNA。其中，上述从白酒大曲或酒醅中提取微生物总DNA的方法中，所述白酒大曲种类为高温大曲、中温大曲或低温大曲。其中，上述从白酒大曲或酒醅中提取微生物总DNA的方法步骤a中，所述白酒大曲或酒醅量为3～10g。其中，上述从白酒大曲或酒醅中提取微生物总DNA的方法步骤a中，PBS缓冲液加入量为每克白酒大曲或酒醅加入2～4mLPBS缓冲液。其中，上述从白酒大曲或酒醅中提取微生物总DNA的方法步骤a中，离心力为150～200g，时间为3～5min。其中，上述从白酒大曲或酒醅中提取微生物总DNA的方法步骤b中，离心力为9000～11000g，离心时间8～12min。其中，上述从白酒大曲或酒醅中提取微生物总DNA的方法步骤c中，重悬的PBS缓冲液的体积为0.5～1mL。其中，上述从白酒大曲或酒醅中提取微生物总DNA的方法中，所述反复冻融过程中，液氮冷冻时间为10～120s，加热温度为50～70℃，加热时间为1～4min，反复冻融次数为2～5次。其中，上述从白酒大曲或酒醅中提取微生物总DNA的方法中，反复冻融后依次加入溶壁酶、溶菌酶、RNA酶和蛋白酶K并分别在相应的酶反应温度下反应。进一步地，上述从白酒大曲或酒醅中提取微生物总DNA的方法中，所述溶壁酶的加入量为控制反应初始时其在PBS溶液中的浓度为0.1～0.5g/L。进一步地，上述从白酒大曲或酒醅中提取微生物总DNA的方法中，所述溶壁酶的反应温度为30℃，时间为1～2h。进一步地，上述从白酒大曲或酒醅中提取微生物总DNA的方法中，所述溶菌酶的加入量为控制反应初始时其在PBS溶液中的浓度为0.1～0.5g/L。进一步地，上述从白酒大曲或酒醅中提取微生物总DNA的方法中，所述溶菌酶的反应温度为37℃，时间为0.5～1.5h。进一步地，上述从白酒大曲或酒醅中提取微生物总DNA的方法中，所述RNA酶的加入量为控制反应初始时其在PBS溶液中的浓度为0.1～0.5g/L。进一步地，上述从白酒大曲或酒醅中提取微生物总DNA的方法中，所述RNA酶的反应温度为37℃，时间为1～2h。进一步地，上述从白酒大曲或酒醅中提取微生物总DNA的方法中，所述蛋白酶K的加入量为控制反应初始时其在PBS溶液中的浓度为0.05～0.5g/L。其中，上述从白酒大曲或酒醅中提取微生物总DNA的方法中，所述蛋白酶K的反应温度为65℃，时间为0.5～1.5h。其中，上述从白酒大曲或酒醅中提取微生物总DNA的方法中，使用的试剂盒为土壤基因组提取试剂盒。有益效果：本专利技术所提供的提取微生物总DNA的方法，与现有技术相比具有以下优点：1、在含微生物的样品预处理阶段，采用了反复冻融方法，使得细胞破裂，有助于后续的基因组提取；在细胞破裂后，依次使用了溶壁酶、溶菌酶、RNA酶和蛋白酶K，不仅能提高基因组提取的量，还能有效的去除基因组中RNA和其他杂质，提高了所提基因组的质量，最后加入蛋白酶K还可去除前面步骤中所加入的酶；2、本专利技术的方法中试剂易于获取，操作方法也较为简单，利用酶、物理相结合的方法破壁，得到的真菌及细菌的基因组DNA较为完整，纯度也高，提取质量稳定。且该方法有助于提高大曲微生物和酒醅微生物总DNA的提取质量，具有良好的应用前景；3、本专利技术的方法不仅适用于大曲微生物总DNA的提取，对于提取酒醅微生物总DNA也有较好的效果。附图说明图1为不同样品基因组DNA琼脂糖凝胶电泳检测结果图；其中1为高温大曲样品，2为中温大曲样品，3为低温大曲样品，4为酒醅样品。图2为不同样品基因组DNA扩增16SrDNA和ITS琼脂糖凝胶电泳检测结果图；其中1为高温大曲样品，2为中温大曲样品，3为低温大曲样品，4为酒醅样品。图3为对比例中提取大曲中的基因组DNA琼脂糖凝胶电泳检测结果图；其中1是对比例1；2是对比例2；3是对比例3；4是对比例4；5是对比例5；6是对比例6。具体实施方式本专利技术提供了从白酒大曲或酒醅中提取微生物总DNA的方法，包括以下步骤：a、称取3～10g的白酒大曲或酒醅，按照每克白酒大曲或酒醅中加入2～4mLPBS缓冲液的比例加PBS缓冲液，加入玻璃本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.从白酒大曲或酒醅中提取微生物总DNA的方法，其特征在于：包括以下步骤：/n从白酒大曲或酒醅中收集菌体，反复冻融后加酶反应，然后使用试剂盒提取微生物总DNA。/n

【技术特征摘要】
1.从白酒大曲或酒醅中提取微生物总DNA的方法，其特征在于：包括以下步骤：
从白酒大曲或酒醅中收集菌体，反复冻融后加酶反应，然后使用试剂盒提取微生物总DNA。


2.根据权利要求1所述的从白酒大曲或酒醅中提取微生物总DNA的方法，其特征在于：包括以下步骤：
a、白酒大曲或酒醅中加PBS缓冲液震荡、离心后，收集上清液；重复前述步骤，合并上清液；
b、将收集的上清液离心后，收集菌体沉淀；
c、将菌体沉淀重悬于PBS缓冲液中，得菌体重悬液；
d、将菌体重悬液反复冻融后加酶反应，然后使用试剂盒提取微生物总DNA。


3.根据权利要求1或2所述的从白酒大曲或酒醅中提取微生物总DNA的方法，其特征在于：所述白酒大曲种类为高温大曲、中温大曲或低温大曲。


4.根据权利要求2或3所述的从白酒大曲或酒醅中提取微生物总DNA的方法，其特征在于：步骤a中，PBS缓冲液加入量为每克白酒大曲或酒醅加入2～4mLPBS缓冲液。


5.根据权利要求1～4任一项所述的从白酒大曲或酒醅中提取微生物总DNA的方法，其特征在于：所述反复冻融过程...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵鑫锐，张清玫，陈坚，李江华，赵东，乔宗伟，郑佳，刘多涛，雷学俊，施思，
申请(专利权)人：宜宾五粮液股份有限公司，江南大学，
类型：发明
国别省市：四川;51