一种海鞘幼体微量组织总RNA的提取方法技术

本发明专利技术公开了一种海鞘幼体微量组织样品总RNA的提取方法，涉及分子生物学研究领域，主要步骤包括：钨针分离微量组织样品；超声波破碎裂解；乙醇沉淀总RNA；乙醇和Tris缓冲液洗涤总RNA；无RNase的水洗脱总RNA。利用实时荧光定量PCR和全转录组扩增技术对提取的总RNA进行质检，表明本发明专利技术方法可高效提取海鞘幼体微量样本中的总RNA，且获得RNA的质量较高，满足相关分子生物实验需求。本发明专利技术能够解决生物幼体阶段微量组织或器官样品总RNA提取的难题，为海洋生物转录组或基因组等分子生物学研究提供技术支撑。

【技术实现步骤摘要】
一种海鞘幼体微量组织总RNA的提取方法
本专利技术属于分子生物学领域，尤其涉及一种海鞘幼体微量组织样本总RNA的提取方法，旨在成功提取海洋生物幼体阶段微量组织样品的总RNA，用于后续的转录组或基因组等分子生物学实验。
技术介绍
海鞘(Ascidians)是隶属于脊索动物门、尾索动物亚门的被囊动物，其种类繁多，在全球海域范围内广泛分布。海鞘的生活史可以分为幼体与成体两个发育阶段。从胚胎孵化出的海鞘幼体呈蝌蚪状，尾部有一条脊索，头部长有乳突结构。海鞘幼体经过数小时的自由游动时期后，利用乳突结构附着在水下岩石、船体等人工设施之上，经过逆行变态后脊索退化消失，发育至成体阶段，营永久的固着滤食生活。海鞘在生物进化史中是无脊椎动物向脊椎动物过渡的重要生物类群，分类地位特殊，已经成为遗传、发育与进化生物学等研究领域的模式生物，具有极高的研究价值。同时，大多数海鞘物种都具有生物入侵和生物污损的特性，已经给全球海洋生态系统带来巨大威胁。海鞘可以借助于跨海域的船舶运输等途径成功入侵到世界各地海域，威胁入侵地海洋生态系统的健康和稳定。黏附的海鞘往往产生生物污损问题，对船舶运输、水产养殖、水利设施等国民经济重要行业造成严重的经济损失。由此可见，开展海鞘生物学相关的研究，尤其是针对自由游动的幼体阶段开展研究，不仅是生物学领域关注的焦点，也是解决生物入侵和生物污损等海洋生态环境问题的重要途径，相关研究结果具有广泛的代表性。利用基因组学和转录组学等高通量技术手段分析某些特定组织或器官的基因表达特征，如今已经成为研究海洋生物生理生化过程以及分子调节机制的可行方法。这种技术手段应用的前提，需要从特定组织或器官中提取出高质量的RNA。目前针对海鞘类生物常用的总RNA提取方法包括Trizol法和各种试剂盒提取法等，试剂盒提取法按照核酸吸附方式又可以分为磁珠法和吸附柱法等，都已经成功的用于海鞘幼体总RNA的提取。然而，现有的这些提取方法只能利用海鞘幼体的整个个体，往往是数十只、甚至上千只个体混合在一起作为样品进行RNA提取。基因表达具有组织特异性，获得单个组织或器官的基因表达特征是深入解析海鞘基因功能和调控机制的关键所在，而目前尚缺乏针对海鞘幼体阶段组织或器官的总RNA的特异性提取方法。幼体时期的海鞘，个体微小，总长只有1mm左右，整个个体的细胞总数约为2600个，单一组织或器官往往只有几十或几百个细胞，样本量较少，获得完整的组织或器官样品较为困难。此外，海鞘幼体外侧具有被膜等保护结构，常规总RNA提取试剂盒中的细胞裂解液无法进入幼体体内直接发挥作用，提取效率往往较低。由于浓度较低，从微量组织样品中获得的RNA无法用常规的凝胶电泳和分光光度计等方法进行质量检测。这些问题的存在，使得人们很难用常规的提取方法来获取这些微量组织或器官的总RNA。因此，针对海鞘幼体阶段的微量组织或器官样品，亟需开发一种有效的提取总RNA的方法。获得高质量的海鞘微量组织样品的总RNA，对多个学科领域的研究都是亟需的，例如从发育生物学角度出发研究组织器官的起源、进化与发育模式，从生态学角度出发研究海洋生物入侵和污损问题等。鉴于海鞘的模式生物属性和分子生物学研究方法的通用性，海鞘幼体阶段的微量组织样品总RNA提取方法的建立，对于其他生物物种微量组织总RNA提取方法的建立和改进也具有较好的借鉴意义。
技术实现思路
为克服现有技术不足，本专利技术的主要目的在于能够提供一种在极微量的海鞘幼体组织或器官样品中有效提取总RNA的方法。该提取方法效率高、操作简便、获得的RNA质量较高，能够满足后续分子生物学实验需求，适合从微量生物样品中提取总RNA。本专利技术所提供的海鞘幼体微量组织总RNA提取方法，包括如下步骤：1)将海鞘幼体加入到预先滴在载玻片上的灭菌海水中，解剖并分离目标组织或器官样品，将分离的组织或器官样品转移至细胞裂解液；2)将含有组织或器官样品的细胞裂解液置于冰上，超声波破碎，获得匀浆液；3)将匀浆液室温放置5-10min，20000g离心3min，弃沉淀，吸取上清液转移至离心管中；4)加入70％(体积含量)的乙醇到上清液中，混匀，转移至RNA吸附柱中，9000g离心30s，舍弃离心液；5)向吸附柱中加入70％(体积含量)的乙醇洗涤，9000g离心30s，舍弃离心液；6)向吸附柱中加入洗涤缓冲液，9000g离心30s，舍弃离心液；7)向吸附柱中加入80％(体积含量)乙醇，9000g离心2min，舍弃离心液；8)将吸附柱以20000g开盖离心5min，舍弃离心液；9)将吸附柱放入新的离心管中，向吸附柱的中心加入无RNase的水，静置，20000g离心1min，收集洗脱的液体，获得总样品RNA。上述方法步骤1)中，所述海鞘幼体为新鲜的海鞘幼体；所述灭菌海水通过如下方法制备得到：将自然海水经0.45μm滤膜过滤后，121℃灭菌30min，即得。所述解剖在解剖镜下进行，用直径为5μm的钨针进行解剖；分离的组织或器官为内脏、头部、尾部、乳突等；所述细胞裂解液的成分为：4mol/L异硫氰酸胍、25mmol/L柠檬酸钠(pH7.0)、0.5％十二烷基肌酸钠、40mmol/L二硫苏糖醇(DTT)；所述细胞裂解液的体积可为300-400μL；步骤2)中，所述超声波破碎通过超声波细胞破碎仪进行；所述超声波细胞破碎仪的变幅杆为ΦⅡ型。所述超声波破碎的参数设置为：破碎总时长2min、工作时间r为1.0s、间歇时间P为3.0s、功率为25％-27％；步骤3)中，所述离心管的体积可为1.5mL；步骤4)中，所述70％(体积含量)乙醇的体积可为300-400μL(与细胞裂解液等体积)；所述混匀通过移液器吹打实现；步骤5)中，洗涤用70％乙醇的体积可为300-400μL；步骤6)中，所述洗涤缓冲液为：50mMTris(pH6.8)和无水乙醇按照1：4(体积比)比例制备的混合液；所述洗涤缓冲液的体积可为400-600μL；步骤7)中，所述80％乙醇的体积可为400-600μL；步骤9)中，所述新的离心管为新的1.5mL离心管；无RNase的水的体积可为12-15μL；所述静置的时间可为1-2min。上述方法中所使用的细胞裂解液也属于本专利技术的保护范围。所述细胞裂解液的成分为：4mol/L异硫氰酸胍、25mmol/L柠檬酸钠(pH7.0)、0.5％十二烷基肌酸钠、40mmol/L二硫苏糖醇(DTT)。基于上述技术方案，本专利技术提供了用于海鞘幼体微量样本RNA的技术方法，在细胞裂解液中直接对解剖下的微量组织或器官进行超声破碎，离心去除不溶物后加入RNA吸附柱中，通过洗涤去除杂质，最终洗脱获得纯RNA样品。经验证，本专利技术方法操作相对简单、RNA损失小、获取的RNA质量好，可用于后续的分子生物实验与分析工作。附图说明图1为实施例2实时荧光定量PCR扩增结果分析图，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种海鞘幼体微量组织总RNA提取方法，包括如下步骤：/n1)将海鞘幼体加入到预先滴在载玻片上的灭菌海水中，解剖并分离目标组织或器官样品，将分离的组织或器官样品转移至细胞裂解液；/n2)将含有组织或器官样品的细胞裂解液置于冰上，超声波破碎，获得匀浆液；/n3)将匀浆液室温放置5-10min，20000g离心3min，弃沉淀，吸取上清液转移至离心管中；/n4)加入70％的乙醇到上清液中，混匀，转移至RNA吸附柱中，9000g离心30s，舍弃离心液；/n5)向吸附柱中加入70％的乙醇洗涤，9000g离心30s，舍弃离心液；/n6)向吸附柱中加入洗涤缓冲液，9000g离心30s，舍弃离心液；/n7)向吸附柱中加入80％乙醇，9000g离心2min，舍弃离心液；/n8)将吸附柱以20000g开盖离心5min，舍弃离心液；/n9)将吸附柱放入新的离心管中，向吸附柱的中心加入无RNase的水，静置，20000g离心1min，收集洗脱的液体，获得总样品RNA。/n

【技术特征摘要】
1.一种海鞘幼体微量组织总RNA提取方法，包括如下步骤：
1)将海鞘幼体加入到预先滴在载玻片上的灭菌海水中，解剖并分离目标组织或器官样品，将分离的组织或器官样品转移至细胞裂解液；
2)将含有组织或器官样品的细胞裂解液置于冰上，超声波破碎，获得匀浆液；
3)将匀浆液室温放置5-10min，20000g离心3min，弃沉淀，吸取上清液转移至离心管中；
4)加入70％的乙醇到上清液中，混匀，转移至RNA吸附柱中，9000g离心30s，舍弃离心液；
5)向吸附柱中加入70％的乙醇洗涤，9000g离心30s，舍弃离心液；
6)向吸附柱中加入洗涤缓冲液，9000g离心30s，舍弃离心液；
7)向吸附柱中加入80％乙醇，9000g离心2min，舍弃离心液；
8)将吸附柱以20000g开盖离心5min，舍弃离心液；
9)将吸附柱放入新的离心管中，向吸附柱的中心加入无RNase的水，静置，20000g离心1min，收集洗脱的液体，获得总样品RNA。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1)中，所述灭菌海水通过如下方法制备得到：将自然海水经0.45μm滤膜过滤后，121℃灭菌30min，即得。


3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤1)中，所述解剖在解剖镜下进行，用尖端直径为5μm的钨针进行解剖。


4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于：分离的组织或器官为内脏、头部、尾部或乳突。


5.根据权利要求1-...

【专利技术属性】
技术研发人员：李世国，战爱斌，程佳威，李茜，
申请(专利权)人：中国科学院生态环境研究中心，
类型：发明
国别省市：北京;11