细菌HI-C基因组及质粒构象捕获方法技术

本发明专利技术公开了细菌HI‑C基因组及质粒构象捕获方法，包括以下捕获步骤：细菌培养、交联反应、验证样品完整性、细菌裂解、消化染色质、生物素填补、连接反应、反向交联、文库提取、去除生物素、酚氯仿提取DNA、二代建库。通过甲醛处理将DNA与蛋白质交联在一起从而固定DNA的构象，并进行酶切、生物素引入、酶连和提取，然后对处理好的核酸进行文库构建和高通量测序，最终通过对测序数据进行分析即可揭示细菌染色质片段之间及其与质粒间的交互信息，可以应用于基因组组装、基因表达调控研究等。

【技术实现步骤摘要】
细菌HI-C基因组及质粒构象捕获方法
本专利技术涉及染色体构象捕获领
，具体为细菌HI-C基因组及质粒构象捕获方法。
技术介绍
Hi-C主要步骤是先制备适合Hi-C的3C模板，限制酶切割后末端连接生物素标记的核苷酸。钝端连接之后DNA纯化剪切。生物素PuLL-down保证只有连接的部分用于分析。测序短读序列Reads被定位到基因组上，当这一对短读序列发现在不同片段上的时候，对互作片段进行相应评分。这样，一个包含基因组所有片段的连接频率矩阵被构建。通过4C确定试验在Hi-C可以得到验证。Hi-C试验让科学家们发现，染色质存在特定的染色质区隔，染色质和异染色质在不同的区域；人类不同类型细胞系，细胞核染色质组织大致相同；细菌的基因组DNA及质粒亦存在三维构象和相互作用。总之，Hi-C方法是全基因组范围内，不限制特定互作蛋白为局限，利用高通量测序(二代或三代)的基于“全对全”模式的染色质互作构象分析方法。在人类和小鼠上都有相关发现发表。目前，现在的Hi-C染色体构象捕获技术还不成熟，容易出错，尤其是细菌基因组及质粒的构象捕获方法。
技术实现思路
为了克服现有技术方案的不足，本专利技术提供细菌HI-C基因组及质粒构象捕获方法，能有效的解决
技术介绍
提出的问题。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：细菌HI-C基因组及质粒构象捕获方法，包括以下捕获步骤：步骤S1：细菌培养。用接种环蘸取少量的菌液，划线于LB琼脂平板，并将该平板放于37℃培养箱培养18-24小时；挑单菌于50mL的LB肉汤中，在37℃的环境下摇床培养3小时15分钟；收集全部菌液，在4℃环境下，以5000rpm离心运动8分钟，弃掉培养液，收集细菌沉淀；加入6mL新鲜的LB肉汤，重悬细菌，洗涤；然后在4℃环境下，以5000rpm离心运动8分钟，收集细菌沉淀；步骤S2：交联反应。配制20mL3％的甲醛溶液，加入到含有细菌沉淀的50mL的离心管中，重悬细菌沉淀，在37℃环境下培养15分钟并每隔2分钟摇晃；加入4.5mL2.5M甘氨酸，充分振荡混合，然后在37℃环境下摇床下培养5分钟，然后在4℃环境下培养15分钟并每隔2分钟摇晃；在4℃环境下以5000rpm离心8分钟，收集交联细菌；加入4mL1*TE缓冲液，重悬细菌，然后在4℃环境下以5000rpm离心8分钟；再次加入3mL1*TE缓冲液，重悬细菌，将固定细菌的菌液平均分装于多个2mL的EP管内；然后在4℃环境下以5000rpm离心8分钟并丢弃上清液；使用液氮迅速将细菌沉淀冻结，放入-80℃冰箱保存；步骤S3：验证样品完整性。取出其中一个平行样品，采用试剂盒提取DNA；步骤S4：细菌裂解。将交联反应的细菌从-80℃的冰箱取出，放在冰上融化约30分钟；向细菌沉淀物中加入100μL溶菌酶，在30℃环境下孵育15分钟并加入1.5mLDEPC水补足体积；步骤S5：消化染色质。配制限制性反应混合物，并将该混合物加入细菌裂解液中，吹打混匀，在37℃水浴液中培养过夜，中途摇晃处理，然后立即放于冰上；步骤S6：生物素填补。配制体系一加入到上一步的细菌消化液中，吹打混匀，在25℃环境下培养2小时，中途摇晃；向混合物中加入适量的EDTA(终浓度为10mM)，在75℃环境下孵育20分钟使酶灭活；在4℃环境下以15000rpm离心运动30分钟，去除上清液，加入300μLDEFC水，重悬沉淀；步骤S7：连接反应。配制体系二，将上一步每管细菌液加入到新配制的体系混合物中，并上下颠倒混匀；在37℃环境下孵育4小时，中途摇晃；然后在65℃环境下孵育10分钟，灭活酶；最后加入10μLRNase在室温环境下孵育5分钟；步骤S8：反向交联。向连接产物中加入100μL蛋白酶K，在65℃环境下孵育3小时；步骤S9：文库提取。加入1.2体积的DNA提取液，上下颠倒均匀，室温静置10分钟；在4℃环境下以14000rpm离心运动10分钟，用移液枪将上层液体转动到新的15mL离心管内；再次加入1.2体积的DNA提取液，上下颠倒均匀，室温静置10分钟；在4℃环境下以14000rpm离心运动10分钟，用移液枪将上层液体转动到新的15mL离心管内；加入0.1体积的3M乙酸钠、2μL5.0mg/mL糖原，上下颠倒均匀；加入2体积冷的100％乙醇，上下颠倒均匀，然后在-20℃环境下孵育过夜；将孵育过夜的液体分次装于1.5mL离心管内，在4℃环境以14000rpm离心运动25分钟，吸走上清液，离心管底部存在白色沉淀；加入500μL冷的70％的乙醇溶液，洗涤；在4℃环境以14000rpm离心运动20分钟，去掉上清液，重复两次；在室温风干20分钟；加入100μL1*TE缓冲液，溶解沉淀；再用HS试剂盒检测DNA浓度；步骤S10：去除生物素。配制体系三，平均分装于PCR管内，每份55μL，在PCR仪在12℃环境下培养5分钟；加入6μLEDTA(终浓度为10mM)，然后在PCR仪在75℃环境中培养20分钟，灭活酶；步骤S11：酚氯仿提取DNA；步骤S12：二代建库。进一步地，在步骤S4中，使用溶菌酶对细菌进行裂解，去除了剧烈的裂解液SDS溶液的使用，或者使用较为温和的TX-100裂解液，保证了DNA的完整性。进一步地，在步骤S4中，交联细菌融化切勿采用人工融化；对于较难裂的细菌，则加入1.5mL裂解液反应5分钟。进一步地，在步骤S8中，使用高温反向交联，交联时间为3小时，减少高温处理时间，防止细菌DNA降解。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术通过甲醛处理将DNA与蛋白质交联在一起从而固定DNA的构象，并进行酶切、生物素引入、酶连和提取，然后对处理好的核酸进行文库构建和高通量测序，最终通过对测序数据进行分析即可揭示细菌染色质片段之间及其与质粒间的交互信息，可以应用于基因组组装、基因表达调控研究等，实用性强，可适合应用于不同的领域上。附图说明图1为本专利技术捕获方法流程图。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。如图1所示，本专利技术提供了细菌HI-C基因组及质粒构象捕获方法，包括以下捕获步骤：步骤S1：细菌培养。用接种环蘸取少量的菌液，划线于LB琼脂平板，并将该平板放于37℃培养箱培养18-24小时；挑单菌于50mL的LB肉汤中，在37℃的环境下摇床培养3小时15分钟；收集全部菌液，在4℃环境下，以5000rpm离心运动8分钟，弃掉培养液，收集细菌沉淀；加入6mL新鲜的LB肉汤，重悬细菌，洗涤；然后在4℃环境下，以5000rpm离心运动8分钟，收集细菌沉淀；步骤S2：交联反应。配制20mL3％的甲醛溶液，加入到含有细菌沉淀的50mL的离心管中，重悬细菌沉淀，在本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.细菌HI-C基因组及质粒构象捕获方法，其特征在于，包括以下捕获步骤：/n步骤S1：细菌培养。用接种环蘸取少量的菌液，划线于LB琼脂平板，并将该平板放于37℃培养箱培养18-24小时；挑单菌于50mL的LB肉汤中，在37℃的环境下摇床培养3小时15分钟；收集全部菌液，在4℃环境下，以5000rpm离心运动8分钟，弃掉培养液，收集细菌沉淀；加入6mL新鲜的LB肉汤，重悬细菌，洗涤；然后在4℃环境下，以5000rpm离心运动8分钟，收集细菌沉淀。/n步骤S2：交联反应。配制20mL 3％的甲醛溶液，加入到含有细菌沉淀的50mL的离心管中，重悬细菌沉淀，在37℃环境下培养15分钟并每隔2分钟摇晃；加入4.5mL2.5M甘氨酸，充分振荡混合，然后在37℃环境下摇床下培养5分钟，然后在4℃环境下培养15分钟并每隔2分钟摇晃；在4℃环境下以5000rpm离心8分钟，收集交联细菌；加入4mL1*TE缓冲液，重悬细菌，然后在4℃环境下以5000rpm离心8分钟；再次加入3mL1*TE缓冲液，重悬细菌，将固定细菌的菌液平均分装于多个2mL的EP管内；然后在4℃环境下以5000rpm离心8分钟并丢弃上清液；使用液氮迅速将细菌沉淀冻结，放入-80℃冰箱保存。/n步骤S3：验证样品完整性。取出其中一个平行样品，采用试剂盒提取DNA。/n步骤S4：细菌裂解。将交联反应的细菌从-80℃的冰箱取出，放在冰上融化约30分钟；向细菌沉淀物中加入100μL溶菌酶，在30℃环境下孵育15分钟并加入1.5mL DEPC水补足体积。/n步骤S5：消化染色质。配制限制性反应混合物，并将该混合物加入细菌裂解液中，吹打混匀，在37℃水浴液中培养过夜，中途摇晃处理，然后立即放于冰上。/n步骤S6：生物素填补。配制体系一加入到上一步的细菌消化液中，吹打混匀，在25℃环境下培养2小时，中途摇晃；向混合物中加入适量的EDTA(终浓度为10mM)，在75℃环境下孵育20分钟使酶灭活；在4℃环境下以15000rpm离心运动30分钟，去除上清液，加入300μLDEFC水，重悬沉淀。/n步骤S7：连接反应。配制体系二，将上一步每管细菌液加入到新配制的体系混合物中，并上下颠倒混匀；在37℃环境下孵育4小时，中途摇晃；然后在65℃环境下孵育10分钟，灭活酶；最后加入10μL RNase在室温环境下孵育5分钟。/n步骤S8：反向交联。向连接产物中加入100μL蛋白酶K，在65℃环境下孵育3小时。/n步骤S9：文库提取。加入1.2体积的DNA提取液，上下颠倒均匀，室温静置10分钟；在4℃环境下以14000rpm离心运动10分钟，用移液枪将上层液体转动到新的15mL离心管内；再次加入1.2体积的DNA提取液，上下颠倒均匀，室温静置10分钟；在4℃环境下以14000rpm离心运动10分钟，用移液枪将上层液体转动到新的15mL离心管内；加入0.1体积的3M乙酸钠、2μL5.0mg/mL糖原，上下颠倒均匀；加入2体积冷的100％乙醇，上下颠倒均匀，然后在-20℃环境下孵育过夜；将孵育过夜的液体分次装于1.5mL离心管内，在4℃环境以14000rpm离心运动25分钟，吸走上清液，离心管底部存在白色沉淀；加入500μL冷的70％的乙醇溶液，洗涤；在4℃环境以14000rpm离心运动20分钟，去掉上清液，重复两次；在室温风干20分钟；加入100μL 1*TE缓冲液，溶解沉淀；再用HS试剂盒检测DNA浓度。/n步骤S10：去除生物素。配制体系三，平均分装于PCR管内，每份55μL，在PCR仪在12℃环境下培养5分钟；加入6μL EDTA(终浓度为10mM)，然后在PCR仪在75℃环境中培养20分钟，灭活酶。/n步骤S11：酚氯仿提取DNA。/n步骤S12：二代建库。/n...

【技术特征摘要】
1.细菌HI-C基因组及质粒构象捕获方法，其特征在于，包括以下捕获步骤：
步骤S1：细菌培养。用接种环蘸取少量的菌液，划线于LB琼脂平板，并将该平板放于37℃培养箱培养18-24小时；挑单菌于50mL的LB肉汤中，在37℃的环境下摇床培养3小时15分钟；收集全部菌液，在4℃环境下，以5000rpm离心运动8分钟，弃掉培养液，收集细菌沉淀；加入6mL新鲜的LB肉汤，重悬细菌，洗涤；然后在4℃环境下，以5000rpm离心运动8分钟，收集细菌沉淀。
步骤S2：交联反应。配制20mL3％的甲醛溶液，加入到含有细菌沉淀的50mL的离心管中，重悬细菌沉淀，在37℃环境下培养15分钟并每隔2分钟摇晃；加入4.5mL2.5M甘氨酸，充分振荡混合，然后在37℃环境下摇床下培养5分钟，然后在4℃环境下培养15分钟并每隔2分钟摇晃；在4℃环境下以5000rpm离心8分钟，收集交联细菌；加入4mL1*TE缓冲液，重悬细菌，然后在4℃环境下以5000rpm离心8分钟；再次加入3mL1*TE缓冲液，重悬细菌，将固定细菌的菌液平均分装于多个2mL的EP管内；然后在4℃环境下以5000rpm离心8分钟并丢弃上清液；使用液氮迅速将细菌沉淀冻结，放入-80℃冰箱保存。
步骤S3：验证样品完整性。取出其中一个平行样品，采用试剂盒提取DNA。
步骤S4：细菌裂解。将交联反应的细菌从-80℃的冰箱取出，放在冰上融化约30分钟；向细菌沉淀物中加入100μL溶菌酶，在30℃环境下孵育15分钟并加入1.5mLDEPC水补足体积。
步骤S5：消化染色质。配制限制性反应混合物，并将该混合物加入细菌裂解液中，吹打混匀，在37℃水浴液中培养过夜，中途摇晃处理，然后立即放于冰上。
步骤S6：生物素填补。配制体系一加入到上一步的细菌消化液中，吹打混匀，在25℃环境下培养2小时，中途摇晃；向混合物中加入适量的EDTA(终浓度为10mM)，在75℃环境下孵育20分钟使酶灭活；在4℃环境下以15000rpm离心运动30分钟，去除上清液，加入300μLDEFC水，重悬沉淀。
步骤S7：连接反应。配制体系二，将上一步每管细菌液加入到新配制的体系混合物中，并上下颠倒混匀；在37℃环境下孵育4...

【专利技术属性】
技术研发人员：连新磊，冯晓茵，李梦圆，孙坚，刘雅红，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东;44