一种含有CD10-dm蛋白的外泌体及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及细胞生物学领域，具体涉及一种含有CD10‑dm蛋白并且能靶向到脑组织的外泌体及其制备方法和应用。本发明专利技术的外泌体装载有酶活性及特异性增强的CD10蛋白，并且外泌体表面展示能靶向结合脑神经细胞乙酰胆碱受体的RVG短肽。该外泌体经静脉给药后，可以穿过血脑屏障，与乙酰胆碱受体阳性的神经细胞特异结合，从而将CD10‑dm蛋白运送至神经细胞内，高效并特异的降解引起阿兹海默病的Aβ蛋白，增强抗炎基因的表达，同时抑制促炎基因的表达。此外，该外泌体与受体细胞的相容性好，不会引起受体的免疫反应和炎症反应，能显著降低基因治疗的毒副作用；对阿兹海默病的治疗具有积极作用。

【技术实现步骤摘要】
一种含有CD10-dm蛋白的外泌体及其制备方法和应用
本专利技术涉及细胞生物学领域，具体涉及一种装载CD10-dm蛋白并且能靶向到脑组织的外泌体及其制备方法和应用。
技术介绍
阿兹海默病(Alzheimer’sDisease,AD)是严重威胁人类健康的神经退行性病变，探索安全高效的治疗方案是医学研究的热点。脑啡肽酶(CD10)属于锌依赖的金属蛋白酶，广泛表达于各种细胞。CD10可以在疏水氨基酸氨基端切割蛋白质，从而使多种肽类激素失活。CD10也可以切割引起阿兹海默病的Aβ蛋白。CD10经基因工程引入G399V/G714K双突变(CD10-dm)后可以使其活性增加20倍，切割肽类激素的活性降低3200倍，从而大大提高了CD10切割Aβ蛋白的活性及特异性，因此对阿兹海默病具有巨大的治疗潜能。外泌体(exosome)是几乎所有细胞分泌的，直径约40-150nm的含脂质双层膜的纳米颗粒。外泌体也存在于所有体液中，是细胞-细胞通讯和物质交换的重要方式。外泌体是由细胞膜连续两次内陷形成的：细胞膜内陷形成内含体，内含体的膜内陷形成多囊泡体，多囊泡体与细胞膜融合释放外泌体。在内含体的膜内陷时，选择性地包裹胞浆中的蛋白质，脂质，及miRNA、mRNA、DNA、lncRNA等核酸。当外泌体与受体细胞结合后，将其内容物运送到受体细胞，进而影响受体细胞生理及病理过程。此外，由于外泌体的膜来源于细胞膜的两次连续内陷，因此外泌体膜蛋白的空间构象与细胞膜蛋白一致，籍此可以通过基因工程修饰细胞膜蛋白从而将归巢肽(配体)展示在外泌体的表面，赋予外泌体靶向性。研究发现，外泌体具有良好的生物分布和组织相容性，天然，稳定，保护所包裹分子不被降解，可穿透生物屏障，低免疫源性/毒性，还可以同时携带多种治疗制剂，是理想的药物运送载体。虽然，生理条件下机体分泌的CD10可以降解脑神经细胞中及分泌到胞外的Aβ蛋白，但是在阿兹海默病时，神经细胞内大量的Aβ蛋白堆积及聚集。另外自然生成的CD10降解Aβ蛋白的特异性不强。因此，提高CD10的活性同时降低其水解肽类激素的活性，将提高其对阿兹海默病的治疗作用。但外源性重组CD10经静脉给药后不能穿透血脑屏障，而且容易被降解，因此需要借助于药物运送载体。传统的药物运送载体(如脂质体)可以运送重组蛋白类药物，但其制备成本高、半衰期短、漏药、脂质体融合、磷脂的氧化、及可溶性低等缺陷，因此需要寻找一种更加安全、高效的药物运送载体。由于外泌体具有天然稳定、纳米尺寸、低免疫原性、无细胞毒性、且能穿过生物屏障等优良特性，外泌体作为药物运送载体将具有巨大的应用价值。天然形成的外泌体在形成过程中选择性富集胞浆中的信号分子，但其选择机制尚待进一步了解。因此，治疗药物的包裹仍是外泌体药物运送技术的难点之一。目前，将外源药物装载主要有以下方法：(1)电转染：将药物与外泌体混合，通过电穿孔的方式将其导入外泌体；(2)反复冻融法：将外泌体与药物混合后反复冻融将其包装到外泌体；(3)超声法：将外泌体与药物混合后通过超声将其包装到外泌体；(4)借助化学药物(Saponin)穿孔法：将外泌体、治疗药物、及Saponin混合后，利用Saponin的膜穿孔作用将药物包入外泌体中；(5)采用基因工程细胞：将编码治疗蛋白的基因克隆到表达载体中，将该载体在外泌体“发生细胞”中过表达，胞浆中过量表达的目的蛋白在外泌体的形成过程中就被包装到外泌体中。前四种方法主要借助一定的理化刺激改变外泌体膜的结构完整性，从而将外源药物被动装载到外泌体内。这些方法在某种程度上改变外泌体的膜结构或者引入了化学物质(如Saponin)，而且包装效率有限。而第(5)种方法因不同的重组蛋白在不同细胞中的表达、载体的种类，及细胞的转染方法等因素的限制，需要根据载体的种类、“发生细胞”的种类及培养方法、培养环境等进行针对性选择，才可能得到装载容量大、稳定性及相容性好的外泌体。此外，方法(5)还可以对外泌体进行靶向修饰。天然来源的外泌体具有一定的靶向性，但是其靶向的机理尚未了解，因此无法选择性的利用。由于外泌体的膜来源于细胞膜连续两次内陷，因此外泌体膜蛋白的空间构象与细胞膜蛋白一致，籍此可以通过基因工程修饰细胞膜蛋白从而将归巢肽(配体)展示在外泌体的表面，赋予外泌体靶向性。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种装载有大量CD10-dm蛋白、并能够靶向脑神经细胞的外泌体，同时提供了该外泌体的制备方法和在用于制备治疗阿兹海默病的药物上的相关应用。为达到上述专利技术目的，本专利技术提供了一种外泌体，所述外泌体装载有过表达CD10-dm基因的细胞生成的CD10-dm蛋白，所述外泌体表面展示RVG短肽。所述外泌体能够以乙酰胆碱受体依赖的方式在脑组织靶向富集。本专利技术外泌体装载了大量的CD10-dm蛋白，并且外泌体表面展示了RVG短肽。RVG短肽可以将该外泌体靶向到乙酰胆碱受体阳性的受体细胞，从而能显著提高受体细胞中CD10-dm水平，进而降解引起阿兹海默病的Aβ蛋白及其聚合体，抑制炎症反应相关基因的表达，促进抗炎基因的表达。同时，由于该外泌体具有良好的组织相容性，不会引起受体的免疫反应和炎症反应，克服了传统脂质体载体运送的毒副作用，对阿兹海默病有良好的治疗作用。优选的，所述外泌体中含有大量的CD10-dm蛋白，而常规外泌体中不含有CD10和CD10-dm蛋白。所述外泌体中，过表达CD10-dm和RVG-LAMP2b基因的细胞为CD10-dm和RVG-LAMP2b基因被大量的转录和翻译，因此CD10-dm和RVG-LAMP2b均高水平表达。上述外泌体中CD10-dm的含量越高，则对受体细胞中Aβ的降解作用越强，对阿兹海默病的治疗效果越好；上述外泌体中RVG-LAMP2b的含量越高，则靶向乙酰胆碱受体阳性脑神经细胞的靶向能力越强，对CD10-dm靶向运送的效果越好；所述常规外泌体是指未过表达CD10-dm和RVG-LAMP2b基因的正常细胞分泌的外泌体。优选的，所述外泌体通过过表达CD10-dm和RVG-LAMP2b基因的细胞分泌而形成。为了提高CD10-dm蛋白在RVG修饰的外泌体中的装载量，用RVG-LAMP2b与CD10-dm共转染工具细胞，从此分离的外泌体将在其表面展示RVG，同时富集CD10-dm蛋白。优选的，所述外泌体来源于HeLa细胞。所述HeLa细胞经瞬时转染后过表达CD10-dm和RVG-LAMP2b，从而分泌表面展示RVG短肽内包大量CD10-dm的外泌体。所述外泌体通过过表达CD10-dm和RVG-LAMP2b基因的HeLa细胞分泌而形成。优选的，所述HeLa细胞，是通过以下制备方法制备得到的：A.pLVX-IRES-ZsGreen1-RVG-LAMP2b质粒构建：人工合成RVG短肽的DNA编码序列；将所述RVG短肽的DNA编码序列同框架融合在LAMP2bcDNA信号肽序列与成熟LAMP2b蛋白之间，得到RVG-LAMP2b融合基因序列；将所述RVG-LAMP2b融合基因序克隆到pLVX-IRES-本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种外泌体，其特征在于：所述外泌体装载有过表达CD10-dm基因的细胞生成的CD10-dm蛋白，所述外泌体表面展示RVG短肽。/n

【技术特征摘要】
1.一种外泌体，其特征在于：所述外泌体装载有过表达CD10-dm基因的细胞生成的CD10-dm蛋白，所述外泌体表面展示RVG短肽。


2.根据权利要求1所述的外泌体，其特征在于：所述外泌体中含有CD10-dm蛋白。


3.根据权利要求1所述的外泌体，其特征在于，所述外泌体通过同时过表达CD10-dm和RVG-LAMP2b基因的细胞分泌而形成。


4.根据权利要求3所述的外泌体，其特征在于，所述外泌体来源于过表达CD10-dm和RVG-LAMP2b基因的HeLa细胞。


5.根据权利要求4所述的外泌体，其特征在于：所述过表达CD10-dm和RVG-LAMP2b基因的HeLa细胞是通过以下制备方法得到的：
A.pLVX-IRES-ZsGreen1-RVG-LAMP2b质粒构建：人工合成RVG短肽的DNA编码序列；将所述RVG短肽的DNA编码序列融合在LAMP2bcDNA信号肽与成熟蛋白之间，得到RVG-LAMP2b融合基因序列；将所述RVG-LAMP2b融合基因序列克隆到pLVX-IRES-ZsGreen1载体上，得到pLVX-IRES-ZsGreen1-RVG-LAMP2b质粒；
B.pLVX-IRES-ZsGreen1-CD10-dm质粒构建：利用重叠PCR技术将G399V/G714K双突变引入CD10cDNA中，得到CD10-dmcDNA；将所述CD10-dmcDNA克隆到pLVX-IRES-ZsGreen1载体上，得到pLVX-IRES-ZsGreen1-CD10-dm质粒；<...

【专利技术属性】
技术研发人员：党喜同，毛亮，周锐，
申请(专利权)人：西南医科大学，
类型：发明
国别省市：四川;51