一种大菱鲆肝实质细胞系的建立方法及细胞系技术

本发明专利技术涉及一种大菱鲆肝实质细胞系的建立方法及细胞系，所述方法包括获取大菱鲆的肝组织，将肝组织剪成组织块并冲洗，采用四型胶原酶消化处理并再次冲洗，采用胰蛋白酶对消化处理后得到的组织块再次消化处理，加入原代完全培养基终止消化，得到处理后的组织块；将处理后的组织块均匀的贴到培养瓶中，将贴好的培养瓶置于23摄氏度的培养箱中6h，再将培养瓶倒置6h，正置后加入4ml原代完全培养基中进行原代培养再进行传代培养。通过本发明专利技术建立的大菱鲆肝实质细胞系能够实现连续传代，从而提供大量的大菱鲆肝细胞；建立稳定可持续的大菱鲆肝细胞系能够将其应用于大菱鲆营养代谢的分子细胞生物学研究中，从而在细胞水平上弥补现有技术的不足。

【技术实现步骤摘要】
一种大菱鲆肝实质细胞系的建立方法及细胞系
本专利技术属于细胞培养
，具体涉及一种大菱鲆肝实质细胞系的建立方法及细胞系。
技术介绍
肝脏是生物体内最重要的器官之一，具有营养代谢和免疫调节等多种重要功能。在肝脏中，肝实质细胞是肝脏中最主要的细胞类型，有着贮存糖原、蛋白代谢、脂肪代谢等重要的作用。在水产动物的研究中，鱼类的肝脏被用于生长、免疫、毒性等实验的研究。但由于水产动物个体差异性大，科学研究所得的数据往往组内差异大，实验结果与真实情况存在差异。因此，肝细胞培养在水产研究中的应用越来越普遍。鱼类的细胞系已经在鱼类营养学、毒理学、免疫学、内分泌学等研究领域做出了重要的贡献。然而，目前水产动物细胞的培养多集中于原代培养，而细胞的原代培养与实验所用水产动物的来源有着密切的关系。实验重复性与水产动物的来源密不可分。因此，建立一种稳定且可持续使用的肝细胞系对研究水产动物营养代谢、免疫调节与疾病防御有重要的意义。大菱鲆(ScophthalmusmaximusL.)是一种具有高经济价值，肉质鲜美，生长迅速的食肉鱼类，大菱鲆在欧洲和亚洲都有大规模的养殖。相关技术中，目前在大菱鲆中已建立肌肉细胞系、鳍细胞系和肾细胞系等。大菱鲆肝细胞的培养在之前的研究中虽然有一定的进展，但大菱鲆肝细胞系还没有被建立，无法获取可以连续传代，且维持良好生长状态的大菱鲆肝细胞。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供一种大菱鲆肝实质细胞系的建立方法及细胞系，以解决现有技术中无法获取可以连续传代，且维持良好生长状态的大菱鲆肝细胞的问题。为实现以上目的，本专利技术采用如下技术方案：一种大菱鲆肝实质细胞系的建立方法，包括：获取大菱鲆的肝组织，将所述肝组织剪成组织块并冲洗，采用四型胶原酶消化处理并再次冲洗，采用胰蛋白酶对消化处理后得到的组织块再次消化处理，加入原代完全培养基终止消化，得到处理后的组织块；将处理后的组织块均匀的贴到培养瓶中，将贴好的培养瓶置于23摄氏度的培养箱中6h，再将所述培养瓶倒置6h，正置后加入4ml原代完全培养基中进行原代培养；在原代培养过程中，每三天更换一次原代完全培养基，当迁出的细胞融合并长成细胞单层时进行传代培养；在传代培养过程中，去除原代完全培养基后，加入含1mlEDTA的胰蛋白酶，轻轻摇晃使胰蛋白酶铺满培养瓶底，之后将胰蛋白酶吸出，再加入1ml胰蛋白酶，放入培养箱静置3min，在显微镜下观察细胞收缩的情况，当细胞变圆且未悬浮之前，将胰蛋白酶吸出，拍打瓶底使细胞脱落，后加入8ml原代完全培养基混匀，分别吸入4ml到新的培养瓶中，在培养瓶上标记好传代的时间和传代的代数。当传代超过15代之后，将原代完全培养基换成传代完全培养基。进一步的，还包括：对培养的肝细胞进行PAS染色鉴定是否是肝实质细胞。进一步的，所述对培养的肝细胞进行PAS染色鉴定是否是肝实质细胞，包括：如果肝细胞胞质被染成紫红色，则证明肝细胞为肝实质细胞；如果肝细胞胞质未被染成紫红色，则证明肝细胞为肝纤维细胞。进一步的，还包括：对传代培养超过30代的肝细胞进行染色体核型分析，以检测大菱鲆肝细胞传代的过程中是否出现变异。进一步的，还包括：对传代培养超过25代的肝细胞进行细胞活性检测。进一步的，还包括：将肝细胞接入六孔板中，采用pcDNA3.1-egfp转染肝细胞，在六孔板的每个孔中加入5μg质粒，24h后，在荧光显微镜下观察转染效果。进一步的，基础培养基包括：每100mlDMEM/F12培养基中，加入1ml青霉素链霉素混合液100×；原代完全培养基包括：每100mlDMEM/F12培养基中，20％的胎牛血清，10μg/LEGF，10μg/LFGF，10μg/LHGF，配制好的的培养基用0.22μm滤膜过滤除菌；传代完全培养基包括：每100mlDMEM/F12培养基中，10％的胎牛血清，配制好的的培养基用0.22μm滤膜过滤除菌。进一步的，所述获取大菱鲆的肝组织，将所述肝组织剪成组织块并冲洗，采用四型胶原酶消化处理并再次冲洗，包括：将肝组织剪成1mm3的组织块，用含有双抗的D-PBS冲洗两遍；室温下，在15ml离心管中用0.1％的四型胶原酶消化30min，消化的同时用旋转振荡器进行旋转震荡，使肝组织充分接触胶原酶；用含有双抗的D-PBS冲洗一遍。进一步的，所述采用胰蛋白酶对消化处理后得到的组织块再次消化处理，加入原代完全培养基终止消化，得到处理后的组织块，包括：室温下，在15ml离心管中用0.25％含EDTA的胰蛋白酶对消化处理后得到的组织块消化5min，加入原代完全培养基终止消化。本申请实施例提供一种细胞系，包括：采用上述任一实施例提供的大菱鲆肝实质细胞系的建立方法建立。本专利技术采用以上技术方案，能够达到的有益效果包括：本专利技术提供一种大菱鲆肝实质细胞系的建立方法及细胞系，通过对大菱鲆的选取，获取大菱鲆的肝组织，进行消化处理后进行原代培养，再进行传代培养，从而获取稳定可持续使用的大菱鲆肝细胞系。通过本专利技术建立的大菱鲆肝实质细胞系能够实现在室温下连续传代，且不会出现变异，还可以在对每一代的肝细胞进行低温保存，从而提供大量的大菱鲆肝细胞；而建立稳定可持续使用的大菱鲆肝细胞系，能够将其应用于大菱鲆营养代谢的分子细胞生物学研究中，从而在细胞水平上弥补现有技术的不足。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为本专利技术启动培养第5天肝细胞迁出图；图2为本专利技术启动培养第15天肝细胞迁出图；图3为本专利技术传代第20代大菱鲆肝细胞示意图；图4为本专利技术肝细胞PAS染色图；图5为ALB与CK18蛋白表达图；图6a为100个肝细胞进行染色体计数示意图；图6b为一个细胞的染色体镜下示意图；图6c为染色体配对图；图7为大菱鲆肝细胞活性图；图8为大菱鲆肝细胞转染荧光图。具体实施方式为使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本专利技术的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本专利技术所保护的范围。下面结合附图介绍本申请实施例中提供的一个具体的大菱鲆肝实质细胞系的建立方法及细胞系。本申请实施例中提供的大菱鲆肝实质细胞系的建立方法，包括：S101，获取大菱鲆的肝组织，将所述肝组织剪成组织块并冲洗，采用四型胶原酶消化处理并再次冲洗，采用胰蛋白酶对消化处理后得到的组织块再次消化处理，加入原代完本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种大菱鲆肝实质细胞系的建立方法，其特征在于，包括：/n获取大菱鲆的肝组织，将所述肝组织剪成组织块并冲洗，采用四型胶原酶消化处理并再次冲洗，采用胰蛋白酶对消化处理后得到的组织块再次消化处理，加入原代完全培养基终止消化，得到处理后的组织块；将处理后的组织块均匀的贴到培养瓶中，将贴好的培养瓶置于23摄氏度的培养箱中6h，再将所述培养瓶倒置6h，正置后加入4ml原代完全培养基中进行原代培养；/n在原代培养过程中，每三天更换一次原代完全培养基，当迁出的细胞融合并长成细胞单层时进行传代培养；/n在传代培养过程中，去除原代完全培养基后，加入含1ml EDTA的胰蛋白酶，轻轻摇晃使胰蛋白酶铺满培养瓶底，之后将胰蛋白酶吸出，再加入1ml胰蛋白酶，放入培养箱静置3min，在显微镜下观察细胞收缩的情况，当细胞变圆且未悬浮之前，将胰蛋白酶吸出，拍打瓶底使细胞脱落，后加入8ml原代完全培养基混匀，分别吸入4ml到新的培养瓶中，在培养瓶上标记好传代的时间和传代的代数，当传代超过15代之后，将原代完全培养基换成传代完全培养基。/n

【技术特征摘要】
1.一种大菱鲆肝实质细胞系的建立方法，其特征在于，包括：
获取大菱鲆的肝组织，将所述肝组织剪成组织块并冲洗，采用四型胶原酶消化处理并再次冲洗，采用胰蛋白酶对消化处理后得到的组织块再次消化处理，加入原代完全培养基终止消化，得到处理后的组织块；将处理后的组织块均匀的贴到培养瓶中，将贴好的培养瓶置于23摄氏度的培养箱中6h，再将所述培养瓶倒置6h，正置后加入4ml原代完全培养基中进行原代培养；
在原代培养过程中，每三天更换一次原代完全培养基，当迁出的细胞融合并长成细胞单层时进行传代培养；
在传代培养过程中，去除原代完全培养基后，加入含1mlEDTA的胰蛋白酶，轻轻摇晃使胰蛋白酶铺满培养瓶底，之后将胰蛋白酶吸出，再加入1ml胰蛋白酶，放入培养箱静置3min，在显微镜下观察细胞收缩的情况，当细胞变圆且未悬浮之前，将胰蛋白酶吸出，拍打瓶底使细胞脱落，后加入8ml原代完全培养基混匀，分别吸入4ml到新的培养瓶中，在培养瓶上标记好传代的时间和传代的代数，当传代超过15代之后，将原代完全培养基换成传代完全培养基。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括：
对培养的肝细胞进行PAS染色鉴定是否是肝实质细胞。


3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述对培养的肝细胞进行PAS染色鉴定是否是肝实质细胞，包括：
如果肝细胞胞质被染成紫红色，则证明肝细胞为肝实质细胞；
如果肝细胞胞质未被染成紫红色，则证明肝细胞为肝纤维细胞。


4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括：
对传代培养超过30代的肝细胞进行染色体核型分析，以检测大菱鲆肝细胞传代的过程中是否出现变异。


5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括：
对...

【专利技术属性】
技术研发人员：张文兵，潘明珠，刘家欢，李昕昕，杨梦曦，黄冬，郭衍林，罗凯，刘玥，麦康森，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：山东;37