诱导人多能干细胞分化为肺泡细胞或肺泡类器官的培养基及方法技术

本发明专利技术提供了诱导人多能干细胞分化为肺泡细胞或肺泡类器官的培养基及方法，具体涉及使用小分子激活剂/抑制剂诱导人多能干细胞分化为肺前体细胞或肺泡细胞的培养基及方法。本发明专利技术诱导分化而来的细胞表达典型的肺前体细胞和肺泡细胞生物标志物，其中三维人肺泡类器官具有肺泡样泡状结构，可以作为毒理学研究、药物筛选和肺部疾病研究的材料。

【技术实现步骤摘要】
诱导人多能干细胞分化为肺泡细胞或肺泡类器官的培养基及方法
本专利技术属于细胞生物学与发育生物学交叉领域，涉及诱导人多能干细胞分化为肺泡细胞或肺泡类器官的培养基及方法。
技术介绍
肺是人类主要的呼吸器官，其中肺泡上皮细胞组成的肺泡是肺部实现气体交换功能的基本结构和功能单位。在体外培养肺细胞进行药物筛选、毒性测试和疾病研究是临床医学、药学、发育生物学和细胞生物学等领域的共同需求。然而，人源肺泡细胞一直是一种十分稀缺的资源，相关细胞的分离、纯化和实验室扩大培养的技术均不成熟。尽管目前从人胎儿中分离肺上皮前体细胞的实验流程已经比较成熟，但由于肺泡上皮细胞一般出现在孕26周，因此可用于取样的流产胎儿极难获得，亟需一套能够高效获得人体肺泡细胞或肺泡类器官的方法。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术提供以下技术方案：一方面，本专利技术提供诱导人多能干细胞分化为肺泡细胞或肺泡类器官的方法，所述方法包括以下步骤：a.诱导诱导人多能干细胞分化为原条细胞；b.诱导原条细胞分化为限定性内胚层细胞；c.诱导限定性内胚层细胞分化为前端前肠细胞；d.诱导前端前肠细胞分化为肺前体细胞；e.诱导肺前体细胞分化为肺泡细胞或肺泡类器官。在一些实施方案中，诱导分化使用的基底培养基为LDbasal，LDbasal配方为：DMEM/F12培养基中加入GlutaMAX(1-4mM，优选为1、2、3、4mM，更优选为2mM)、N2补充剂(1×)，B27补充剂(1×)，抗坏血酸-2-磷酸(40-60μg/mL，优选为40、50、60μg/mL，更优选为50μg/mL)。在一些实施方案中，诱导诱导人多能干细胞分化为原条细胞所用培养基为LDM-1，所述LDM-1的配方为：LDbasal培养基中加入ActivinA(20-500ng/mL，优选为20、50、80、100、150、200、250、300、350、400、450、500ng/mL，更优选为100ng/mL)、CHIR99021(1-12μM，优选为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12μM，更优选为3μM)。在一些实施方案中，诱导诱导人多能干细胞分化为原条细胞的诱导时间为1-3天，优选为1、2、3天，更优选为1天。在一些实施方案中，诱导原条细胞分化为限定性内胚层细胞所用的培养基为LDM-2，所述的LDM-2配方为：LDbasal培养基中加入ActivinA(20-500ng/mL，优选为20、50、80、100、150、200、250、300、350、400、450、500ng/mL，更优选为100ng/mL)。在一些实施方案中，诱导限定性内胚层细胞分化为前端前肠细胞所用的培养基为LDM-3，所述LDM-3的配方为：LDbasal培养基中加入SB431542(1-20μM，优选为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20μM，更优选为10μM)、dorsomorphin(1-10μM，优选为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10μM，更优选2μM)。在一些实施方案中，诱导限定性内胚层细胞分化为前端前肠细胞的诱导时间为2-4天，优选为2、3、4天，更优选为3天。在一些实施方案中，诱导前端前肠细胞分化为肺前体细胞所用的培养基为LDM-4，所述LDM-4的配方为：LDbasal培养基中加入CHIR99021(1-12μM，优选为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12μM，更优选为3μM)、视黄酸(10-100nM，优选为10、20、30、40、50、60、70、80、90、100nM，更优选为50nM)、BMP4(1-30ng/mL，优选为1、5、8、15、20、25、30ng/mL，更优选为10ng/mL)、FGF7(10-50ng/mL，优选为10、15、20、25、30、35、40、45、50ng/mL，更优选为10ng/mL)、FGF10(10-50ng/mL，优选为10、15、20、25、30、35、40、45、50ng/mL，更优选为10ng/mL)。在一些实施方案中，诱导前端前肠细胞分化为肺前体细胞的诱导时间为8-10天，优选为8、9、10天，更优选为9天。在一些实施方案中，诱导肺前体细胞分化为肺泡细胞所用的培养基为LDM-5，所述的LDM-5配方为：LDbasal培养基中加入CHIR99021(1-12μM，优选为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12μM，更优选为3μM)、FGF7(10-50ng/mL，优选为10、15、20、25、30、35、40、45、50ng/mL，更优选为10ng/mL)、地塞米松(10-50nM，优选为10、15、20、25、30、35、40、45、50nM，更优选为50nM)、cAMP(0.1-2mM，优选为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0mM，更优选为0.1mM)、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(0.1-2mM，优选为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0mM，更优选为0.1mM)。在一些实施方案中，诱导肺前体细胞分化为肺泡细胞的诱导时间为13-15天，优选为13、14、15天，更优选为14天。在一些实施方案中，诱导肺前体细胞分化为肺泡类器官包括以下步骤：(1)将步骤d获得的肺前体细胞与基质胶溶液混合，形成细胞悬液；(2)将细胞悬液按照每滴20-100μL的量，接种在干燥的细胞培养板里；(3)等待至细胞悬液凝固；(4)加入LDM-5进行诱导；LDM-5的配方为：LDbasal培养基中加入CHIR99021(1-12μM，优选为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12μM，更优选为3μM)、FGF7(10-50ng/mL，优选为10、15、20、25、30、35、40、45、50ng/mL，更优选为10ng/mL)、地塞米松(10-50nM，优选为10、15、20、25、30、35、40、45、50nM，更优选为50nM)、cAMP(0.1-2mM，优选为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0mM，更优选为0.1mM)、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(0.1-2mM，优选为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0mM，更优选为0.1mM)。在一些实施方案中，诱导肺前体细胞分化为肺泡类器官的诱导时间为为13-15天，优选为13、本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.诱导人多能干细胞分化为肺泡细胞或肺泡类器官的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：/na.诱导人多能干细胞分化为原条细胞；/nb.诱导原条细胞分化为限定性内胚层细胞；/nc.诱导限定性内胚层细胞分化为前端前肠细胞；/nd.诱导前端前肠细胞分化为肺前体细胞；/ne.诱导肺前体细胞分化为肺泡细胞或肺泡类器官。/n

【技术特征摘要】
1.诱导人多能干细胞分化为肺泡细胞或肺泡类器官的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
a.诱导人多能干细胞分化为原条细胞；
b.诱导原条细胞分化为限定性内胚层细胞；
c.诱导限定性内胚层细胞分化为前端前肠细胞；
d.诱导前端前肠细胞分化为肺前体细胞；
e.诱导肺前体细胞分化为肺泡细胞或肺泡类器官。


2.根据权利要求1所述诱导人多能干细胞分化为肺泡细胞或肺泡类器官的方法，其特征在于，诱导分化使用的基底培养基为LDbasal，LDbasal配方为：DMEM/F12培养基中加入GlutaMAX(1-4mM，优选为1、2、3、4mM，更优选为2mM)、N2补充剂(1×)，B27补充剂(1×)，抗坏血酸-2-磷酸(40-60μg/mL，优选为40、50、60μg/mL，更优选为50μg/mL)。


3.根据权利要求2所述诱导人多能干细胞分化为肺泡细胞或肺泡类器官的方法，其特征在于，诱导人多能干细胞分化为原条细胞所用培养基为LDM-1，所述LDM-1的配方为：LDbasal培养基中加入ActivinA(20-500ng/mL，优选为20、50、80、100、150、200、250、300、350、400、450、500ng/mL，更优选为100ng/mL)、CHIR99021(1-12μM，优选为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12μM，更优选为3μM)。


4.根据权利要求3所述诱导人多能干细胞分化为肺泡细胞或肺泡类器官的方法，其特征在于，诱导人多能干细胞分化为原条细胞的诱导时间为1-3天，优选为1、2、3天，更优选为1天。


5.根据权利要求2所述诱导人多能干细胞分化为肺泡细胞或肺泡类器官的方法，其特征在于，诱导原条细胞分化为限定性内胚层细胞所用的培养基为LDM-2，所述的LDM-2配方为：LDbasal培养基中加入ActivinA(20-500ng/mL，优选为20、50、80、100、150、200、250、300、350、400、450、500ng/mL，更优选为100ng/mL)。


6.根据权利要求5所述诱导人多能干细胞分化为肺泡细胞或肺泡类器官的方法，其特征在于，诱导限定性内胚层细胞分化为前端前肠细胞所用的培养基为LDM-3，所述LDM-3的配方为：LDbasal培养基中加入SB431542(1-20μM，优选为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20μM，更优选为10μM)、dorsomorphin(1-10μM，优选为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10μM，更优选2μM)。


7.根据权利要求6所述诱导人多能干细胞分化为肺泡细胞或肺泡类器官的方法，其特征在于，诱导限定性内胚层细胞分化为前端前肠细胞的诱导时间为2-4天，优选为2、3、4天，更优选为3天。


8.根据权利要求2所述诱导人多能干细胞分化为肺泡细胞或肺泡类器官的方法，其特征在于，诱导前端前肠细胞分化为肺前体细胞所用的培养基为LDM-4，所述LDM-4的配方为：LDbasal培养基中加入CHIR99021(1-12μM，优选为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12μM，更优选为3μM)、视黄酸(10-100nM，优选为10、20、30、40、50、60、70、80、90、100nM，更优选为50nM)、BMP4(1-30ng/mL，优选为1、5、8、15、20、25、30ng/mL，更优选为10ng/mL)、FGF7(10-50ng/mL，优选为10、15、20、25、30、35、40、45、50ng/mL，更优选为10ng/mL)、FGF10(10-50ng/mL，优选为10、15、20、25、30、35、40、45、50ng/mL，更优选为10ng/mL)。


9.根据权利要求8所述诱导人多能干细胞分化为肺泡细胞或肺泡类器官的方法，其特征在于，诱导前端前肠细胞分化为肺前体细胞的诱导时间为8-10天，优选为8、9、10天，更优选为9天。


10.根据权利要求2所述诱导人多能干细胞分化为肺泡细胞或肺泡类器官的方法，其特征在于，诱导肺前体细胞分化为肺泡细胞所用的培养基为LDM-5，所述的LDM-5配方为：LDbasal培养基中加入CHIR99021(1-12μM，优选为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12μM，更优选为3μM)、FGF7(10-50ng/mL，优选为10、15、20、25、30、35、40、45、50ng/mL，更优选为10ng/mL)、地塞米松(10-50nM，优选为10、15、20、25、30、35、40、45、50nM，更优选为50nM)、cAMP(0.1-2...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨仁君，刘抒羽，殷诺雅，费凡，
申请(专利权)人：中国科学院生态环境研究中心，
类型：发明
国别省市：北京;11