一种易形成芽孢的凝结芽孢杆菌的筛选方法技术

本发明专利技术公开了一种易形成芽孢的凝结芽孢杆菌的筛选方法，属于微生物技术领域。其包括以下步骤：将复壮后的凝结芽孢杆菌重复进行多次水浴‑平板筛选，直至凝结芽孢杆菌的芽孢率不低于95％。上述方法通过对复壮后的凝结芽孢杆菌进行水浴法筛选产孢个体，再通过固体平板培养筛除未形成芽孢的个体，重复进行多次水浴‑平板筛选可提高其遗传稳定性，最终筛选得到易形成芽孢的凝结芽孢杆菌菌体，在保证其产量的同时提升发酵后的芽孢率。该方法简单，操作便捷，能提升凝结芽孢杆菌形成芽孢的能力，菌种不易退化，可大幅度提高凝结芽孢杆菌在高温制粒、长期保存时的存活率，适合大部分常见发酵工艺，有利于推动凝结芽孢杆菌的生产应用。

【技术实现步骤摘要】
一种易形成芽孢的凝结芽孢杆菌的筛选方法
本专利技术涉及微生物
，具体而言，涉及一种易形成芽孢的凝结芽孢杆菌的筛选方法。
技术介绍
凝结芽孢杆菌是一类能形成芽孢、能产乳酸的革兰氏阳性菌。菌体呈杆状，两端钝圆，单个或成短链，可产生芽孢，芽孢端生。其具有一般乳酸菌维持肠道微生态平衡、提高机体消化功能和健康水平的能力外，还具有芽孢菌抗胃酸、抗胆碱、抗热和抗干燥等抗逆能力。凝结芽孢杆菌的高抗逆性源自其能形成芽孢的能力，但是凝结芽孢杆菌的产孢能力远不如一般常用的芽孢杆菌如枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌等，其产孢机理较为复杂。目前生产凝结芽孢杆菌多是通过成分复壮的培养基配方及在过程中进行复杂的补料等来提升凝结芽孢杆菌的芽孢率，导致发酵工艺固定，对设备、原料等级等要求较高，重复性差，且无法普及；并且，一些常用普通的提高芽孢菌芽孢率的驯化方法并不适合凝结芽孢杆菌，无法驯化得高产量且高芽孢率的凝结芽孢杆菌菌体。鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种易形成芽孢的凝结芽孢杆菌的筛选方法，该方法简单，重复性高，可获得高产量且高芽孢率的凝结芽孢杆菌菌种。本申请可这样实现：本申请提供一种易形成芽孢的凝结芽孢杆菌的筛选方法，包括以下步骤：将复壮后的凝结芽孢杆菌重复进行多次水浴-平板筛选，直至凝结芽孢杆菌的芽孢率不低于95％。在可选的实施方式中，水浴-平板筛选包括水浴筛选和平板筛选。水浴筛选包括：将复壮后的凝结芽孢杆菌进行挡板摇瓶培养，随后水浴；平板筛选包括：将水浴筛选后所得的凝结芽孢杆菌接种于第一固体平板上进行有氧培养。在可选的实施方式中，挡板摇瓶培养过程中所用的第一摇瓶培养基的配方包括：第一速效碳源4.5-5.5g/L、第一速效氮源9-11g/L、第一pH调节剂8-9.5g/L、第一生长因子0.3-0.36g/L以及渗透压调节剂1.8-2g/L。在可选的实施方式中，第一速效碳源包括葡萄糖。在可选的实施方式中，第一速效氮源包括蛋白胨、酵母浸膏和酵母浸粉中的至少一种。在可选的实施方式中，第一pH调节剂包括磷酸氢二钾、磷酸氢二钠和碳酸钙中的至少一种。在可选的实施方式中，第一生长因子包括硫酸镁和硫酸锰中的至少一种。在可选的实施方式中，渗透压调节剂包括氯化钠和氯化钾中的至少一种。在可选的实施方式中，第一摇瓶培养基的配方包括葡萄糖4.5-5.5g/L、蛋白胨4.5-5.5g/L、酵母浸粉4.5-5.5g/L、磷酸氢二钾3-3.5g/L、硫酸镁0.2-0.24g/L、硫酸锰0.1-0.12g/L、碳酸钙5-6g/L以及氯化钠1.8-2g/L，起始pH值为6.7-6.9。在可选的实施方式中，挡板摇瓶培养于39-41℃以及180-220r/min的条件下进行38-48h。在可选的实施方式中，水浴于88-90℃的条件下进行10-15min。在可选的实施方式中，平板筛选是于39-41℃的条件下有氧培养42-48h。在可选的实施方式中，第一固体平板为MRS琼脂平板。在可选的实施方式中，水浴-平板筛选的次数为4-9次。在可选的实施方式中，复壮包括：将待复壮的凝结芽孢杆菌接种于摇瓶中培养，复壮过程摇瓶培养所用的第二摇瓶培养基的配方包括：第二速效氮源12-15g/L、第二速效碳源8-10g/L、第二生长因子5.6-7g/L以及第二pH调节剂1.6-2g/L。在可选的实施方式中，第二速效氮源包括蛋白胨、酵母浸膏和酵母浸粉中的至少一种。在可选的实施方式中，第二速效碳源包括葡萄糖。在可选的实施方式中，第二pH调节剂包括磷酸氢二钾和磷酸氢二钠中的至少一种。在可选的实施方式中，第二生长因子包括乙酸钠和柠檬酸二铵中的至少一种。在可选的实施方式中，第二摇瓶培养基的配方包括：蛋白胨8-10g/L、酵母浸粉4-5g/L、葡萄糖8-10g/L、乙酸钠4-5g/L、柠檬酸二铵1.6-2g/L以及磷酸氢二钾1.6-2g/L，起始pH值为6.7-6.9。在可选的实施方式中，复壮过程摇瓶培养于39-41℃以及180-220r/min的条件下进行24-30h。在可选的实施方式中，复壮还包括：将摇瓶培养后的凝结芽孢杆菌接种于第二固体平板，于39-41℃的条件下有氧培养42-48h。在可选的实施方式中，第二固体平板为MRS琼脂平板。本申请的有益效果包括：本申请通过对复壮后的凝结芽孢杆菌进行水浴初步筛选出产孢个体，再通过平板培养进一步筛除未形成芽孢的耐热个体，上述水浴-平板筛选重复进行多次可提高筛选所得菌体的遗传稳定性，并能在保证其产量的同时提升发酵后的芽孢率。该方法简单，操作便捷，能提升凝结芽孢杆菌形成芽孢的能力，菌种不易退化，可大幅度提高凝结芽孢杆菌在高温制粒、长期保存时的存活率，适合大部分常见发酵工艺，有利于推动凝结芽孢杆菌的生产应用。具体实施方式为使本专利技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。下面对本申请提供的易形成芽孢的凝结芽孢杆菌的筛选方法进行具体说明。凝结芽孢杆菌的产孢能力远不如一般常用的芽孢杆菌如枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌等，其产孢机理较为复杂，并非可以简单地可以通过降低碳氮源浓度或人为恶化环境即可实现。凝结芽孢杆菌与其他常见芽孢杆菌的产孢条件差别较大，除了营养缺乏这一条件，常见芽孢菌产孢还可以通过大幅升降温、升降pH或降低通气等方法使环境恶化而促进芽孢形成，而凝结芽孢杆菌却需要在一个较小范围下的适宜温度、pH和通气情况下才能形成，简单地恶化环境会使其菌种死亡而非形成芽孢。除了通过补料和工艺调控的方式，目前生产凝结芽孢杆菌还缺乏对凝结芽孢杆菌菌体本身产孢能力方面的改造。专利技术人经过长期研究，创造性地提出了一种简单有效的易形成芽孢的凝结芽孢杆菌的筛选方法，其包括以下步骤：将复壮后的凝结芽孢杆菌重复进行多次水浴-平板筛选，直至凝结芽孢杆菌的芽孢率不低于95％。在可选的实施方式中，水浴-平板筛选包括水浴筛选，水浴筛选包括：将复壮后的凝结芽孢杆菌进行挡板摇瓶培养，随后水浴；其中，挡板摇瓶培养过程中所用的第一摇瓶培养基的配方包括：第一速效碳源4.5-5.5g/L、第一速效氮源9-11g/L、第一pH调节剂8-9.5g/L、第一生长因子0.3-0.36g/L以及渗透压调节剂1.8-2g/L。可参考地，第一速效碳源可以包括(为)葡萄糖，其作用主要是为了提供速效碳源。第一速效氮源可以包括蛋白胨、酵母浸膏和酵母浸粉中的至少一种，优选同时包括酵母浸膏和酵母浸粉中的一种以及蛋白胨。第一速效氮源的作用主要是为了提供速效氮源。第一pH调节剂可以包括磷酸氢二钾、磷酸氢二钠和碳酸钙中的至少一种，优选同时包括磷酸氢二本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种易形成芽孢的凝结芽孢杆菌的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：将复壮后的凝结芽孢杆菌重复进行多次水浴-平板筛选，直至凝结芽孢杆菌的芽孢率不低于95％。/n

【技术特征摘要】
1.一种易形成芽孢的凝结芽孢杆菌的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：将复壮后的凝结芽孢杆菌重复进行多次水浴-平板筛选，直至凝结芽孢杆菌的芽孢率不低于95％。


2.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述水浴-平板筛选包括水浴筛选和平板筛选；
所述水浴筛选包括：将复壮后的所述凝结芽孢杆菌进行挡板摇瓶培养，随后水浴；
所述平板筛选包括：将水浴筛选后所得的所述凝结芽孢杆菌接种于第一固体平板上培养。


3.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，水浴筛选的挡板摇瓶培养过程中所用的第一摇瓶培养基的配方包括：第一速效碳源4.5-5.5g/L、第一速效氮源9-11g/L、第一pH调节剂8-9.5g/L、第一生长因子0.3-0.36g/L以及渗透压调节剂1.8-2g/L；
优选地，所述第一速效碳源包括葡萄糖；
优选地，所述第一速效氮源包括蛋白胨、酵母浸膏和酵母浸粉中的至少一种；
优选地，所述第一pH调节剂包括磷酸氢二钾、磷酸氢二钠和碳酸钙中的至少一种；
优选地，所述第一生长因子包括硫酸镁和硫酸锰中的至少一种；
优选地，所述渗透压调节剂包括氯化钠和氯化钾中的至少一种。


4.根据权利要求3所述的筛选方法，其特征在于，所述第一摇瓶培养基的配方包括葡萄糖4.5-5.5g/L、蛋白胨4.5-5.5g/L、酵母浸粉4.5-5.5g/L、磷酸氢二钾3-3.5g/L、硫酸镁0.2-0.24g/L、硫酸锰0.1-0.12g/L、碳酸钙5-6g/L以及氯化钠1.8-2g/L，起始pH值为6.7-6.9。


5.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，挡板摇瓶培养于39-41℃以及180-220r/min的...

【专利技术属性】
技术研发人员：张志榕，李炯明，肖俊峰，帅海峰，王小芬，郑甜力，陈志敏，吴贤峰，吴有林，
申请(专利权)人：亚太星原农牧科技海安有限公司，南昌傲农生物科技有限公司，福建傲农生物科技集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32