适配体反蛋白石光子晶体传感材料和快速超灵敏无标记检测金黄色葡萄球菌肠毒素B的方法技术

本发明专利技术属于毒素检测领域，涉及适配体反蛋白石光子晶体传感材料和快速超灵敏无标记检测金黄色葡萄球菌肠毒素B的方法。该适配体反蛋白石光子晶体传感材料由包括如下步骤的方法制得：S1.制备聚甲基丙烯酸甲酯微球；S2.制备SiO

【技术实现步骤摘要】
适配体反蛋白石光子晶体传感材料和快速超灵敏无标记检测金黄色葡萄球菌肠毒素B的方法
本专利技术属于毒素检测领域，具体地，涉及一种适配体反蛋白石光子晶体传感材料，以及快速超灵敏无标记检测金黄色葡萄球菌肠毒素B的方法。
技术介绍
光子晶体(photoniccrystal,PCs)是由两种以上具有不同折光指数的材料在空间按照一定的周期顺序排列所形成的有序结构材料。光子晶体结构的有序性使其具有布拉格衍射峰，这种直接可读的光谱信号赋予其作为传感材料响应信号自表达的特性。同时PCs的结构具有的高比表面积/体积比，使其灵敏性极高。而多层次相互交联且连续有序的结构有利于目标分子在光子晶体传感技术的传输，这些又赋予了其快速响应的特点。反蛋白石光子晶体(InverseOpalPhotonicCrystal,IOPC)是在蛋白石的空隙中填充高折射率的材料，然后通过去除蛋白石结构中的原材料所形成的结构。与传统的蛋白石光子晶体相比，反蛋白石光子晶体更有优势，具有材料折射率可控、三维连通的孔隙结构、弯曲度低、比表面积更大以及能够对光子禁带有着多重调制作用等优势，因此在组织工程、生物传感及可调制光子晶体传感材料等领域拥有良好的应用前景。金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,S.aureus)是引起食物中毒的主要食源性致病菌之一，仅次于沙门氏菌和副溶血性弧菌。金黄色葡萄球菌肠毒素B(Staphylococcalenterotoxin,SEB)作为金黄色葡萄球菌分泌的血清型肠毒素的一种，是引起食物中毒的典型生物毒素。由于其具有热稳定性好、耐高温等特点，经过加工的食物中仍有可能造成毒素残留，我国及世界范围内由金黄色葡萄球菌引起的食品中毒事件被频频报道，其中95％以上为分泌的肠毒素所致。因此，研究SEB的快速检测方法对于食物中毒的临床诊断及预防控制具有重要的意义。SEB的主要传统检测手段包括生物学方法、免疫学方法、仪器分析法及生物传感法。生物学检测方法来源困难、成本较高、特异性差等缺点限制了该方法的应用。免疫检测方法中的ELISA方法检测时间长、重复性差。仪器分析法对仪器要求高，设备贵。因此，需要建立一种超灵敏无标记的检测方法，实现SEB的快速准确检测。
技术实现思路
针对现有技术的缺点，本专利技术要解决的技术问题是提供一种操作简单、检测快速的光子晶体传感技术，以实现食品中金黄色葡萄球菌肠毒素B的超灵敏无标记快速检测。本专利技术提供一种适配体反蛋白石光子晶体传感材料，该适配体反蛋白石光子晶体传感材料由包括如下步骤的方法制得：S1.制备聚甲基丙烯酸甲酯微球：在氮气气氛下，将除氧后的双蒸水、甲基丙烯酸甲酯和过硫酸钾混合，在搅拌条件下水浴加热反应，反应结束后以不同的转速离心，制备得PMMA微球；S2.制备SiO2反蛋白石光子晶体：将PMMA微球悬浮液与TEOS溶液混合，超声充分分散后蒸发干燥、煅烧，得到SiO2反蛋白石光子晶体；S3.制备适配体反蛋白石光子晶体传感材料S3-1：氨基化修饰将制备的SiO2反蛋白石光子晶体振荡清洗，然后加入3-氨丙基三乙氧基硅烷溶液，密封后进行加热反应，得到修饰氨基后的反蛋白石光子晶体；S3-2：胶体金在光子晶体表面的修饰在修饰氨基后的反蛋白石光子晶体表面加入金纳米颗粒，室温下静置反应，反应完成后用双蒸水洗净并用氮气吹干，得到修饰胶体金后的反蛋白石光子晶体；S3-3：将SEB适配体在金属浴中加热，用PBS缓冲液稀释，得到SEB适配体溶液；在修饰胶体金后的反蛋白石光子晶体表面滴加SEB适配体溶液，在恒温培养箱中孵育，得到所述适配体反蛋白石光子晶体传感材料，SEB适配体序列为5'-HS-GGTATTGAGGGTCGCATCCACTGGTCGTTGTTGTCTGTTGTCTGTTATGTTGTTTCGTGATGGCTCTAACTCTCCTCT-3'(SEQIDNO：1)。根据本专利技术一种具体实施方式，所述适配体反蛋白石光子晶体传感材料由包括如下步骤的方法制得：S1.制备聚甲基丙烯酸甲酯微球：把除氧后的双蒸水、甲基丙烯酸甲酯和过硫酸钾，在氮气气氛下间隔依次加入三口烧瓶中，在搅拌条件下水浴加热反应，反应结束后以不同的转速离心，制备得PMMA微球，放于4℃冰箱保存；S2.制备SiO2反蛋白石光子晶体：将盐酸、正硅酸乙酯和无水乙醇混合，室温下震荡孵育，获得TEOS溶液；将载玻片浸泡在水虎鱼溶液中，之后用双蒸水和无水乙醇分别清洗，氮气吹干；取一定量TEOS溶液加入到一定浓度的PMMA微球悬浮液中，超声充分分散后倒入展缸中，放入真空干燥箱中静置蒸发干燥，结束后将光子晶体放于马弗炉中煅烧，PMMA微球在高温下被除去，最终得到SiO2反蛋白石光子晶体；S3.制备适配体反蛋白石光子晶体传感材料S3-1：氨基化修饰将制备的SiO2反蛋白石光子晶体浸泡在水虎鱼溶液中处理，之后用双蒸水和无水乙醇分别震荡清洗，用氮气吹干；然后加入3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)溶液，密封后放入油浴锅中加热反应；结束后用双蒸水振荡清洗；S3-2：制备胶体金以及胶体金在光子晶体表面的修饰将四羟甲基氯化磷(THPC)和氢氧化钠加入水中，剧烈搅拌，然后快速加入氯金酸，溶液颜色变为深棕色，避光搅拌过夜，制备得金纳米颗粒；在修饰氨基后的反蛋白石光子晶体表面加入一定体积的金纳米颗粒，然后在室温下静置，反应完成后用双蒸水洗净并用氮气吹干；S3-3：将在5'端修饰巯基的SEB适配体在金属浴中加热，使用PBS缓冲液稀释适配体；在反蛋白石光子晶体表面滴加适配体溶液，在恒温培养箱中孵育。本专利技术的检测原理如图1所示：通过在PMMA微球溶液中添加酸性催化水解的正硅酸乙酯(TEOS)溶液，用垂直沉积共组装法在载玻片上制备得到微球空隙中填有SiO2凝胶的复合胶体晶体薄膜，采用高温煅烧法去除PMMA模板制备得到SiO2反蛋白石光子晶体，在反蛋白石光子晶体的晶格中修饰胶体金，以SEB适配体作为传感系统的识别元件，研究反蛋白石光子晶体对SEB的响应规律。加入目标物SEB时，适配体将捕获大分子SEB，光子晶体传感材料的表观折射率发生改变，进而影响反射峰强的改变，反射峰的强度随着SEB浓度的升高而降低，实现对SEB的快速检测。根据本专利技术，具体地，步骤S1包括：把除氧后的100-150mL双蒸水、20-30mL甲基丙烯酸甲酯和0.2-0.4g过硫酸钾，在氮气气氛下间隔依次加入三口烧瓶中，以200-400r/min的速度搅拌，70-90℃水浴反应30-60min，反应结束后以不同的转速离心，制备得PMMA微球，放于4℃冰箱保存。更具体地，步骤S1包括：把除氧后的125mL双蒸水、25mL甲基丙烯酸甲酯(MMA)和0.3g过硫酸钾(KPS)，在氮气气氛下间隔3min后依次加入三口烧瓶中，以300r/min的速度搅拌，80℃水浴反应45min。反应结束后以不同的转速离心，制备得PMMA微球，放于4℃冰箱保存。根据本专利技术，具体地，步骤S本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种适配体反蛋白石光子晶体传感材料，该适配体反蛋白石光子晶体传感材料由包括如下步骤的方法制得：/nS1.制备聚甲基丙烯酸甲酯微球：在氮气气氛下，将除氧后的双蒸水、甲基丙烯酸甲酯和过硫酸钾混合，在搅拌条件下水浴加热反应，反应结束后以不同的转速离心，制备得PMMA微球；/nS2.制备SiO

【技术特征摘要】
1.一种适配体反蛋白石光子晶体传感材料，该适配体反蛋白石光子晶体传感材料由包括如下步骤的方法制得：
S1.制备聚甲基丙烯酸甲酯微球：在氮气气氛下，将除氧后的双蒸水、甲基丙烯酸甲酯和过硫酸钾混合，在搅拌条件下水浴加热反应，反应结束后以不同的转速离心，制备得PMMA微球；
S2.制备SiO2反蛋白石光子晶体：将PMMA微球悬浮液与TEOS溶液混合，超声充分分散后蒸发干燥、煅烧，得到SiO2反蛋白石光子晶体；
S3.制备适配体反蛋白石光子晶体传感材料
S3-1：氨基化修饰
将制备的SiO2反蛋白石光子晶体振荡清洗，然后加入3-氨丙基三乙氧基硅烷溶液，密封后进行加热反应，得到修饰氨基后的反蛋白石光子晶体；
S3-2：胶体金在光子晶体表面的修饰
在修饰氨基后的反蛋白石光子晶体表面加入金纳米颗粒，室温下静置反应，反应完成后用双蒸水洗净并用氮气吹干，得到修饰胶体金后的反蛋白石光子晶体；
S3-3：将SEB适配体在金属浴中加热，用PBS缓冲液稀释，得到SEB适配体溶液；在修饰胶体金后的反蛋白石光子晶体表面滴加SEB适配体溶液，在恒温培养箱中孵育，得到所述适配体反蛋白石光子晶体传感材料，
SEB适配体序列为5'-HS-GGTATTGAGGGTCGCATCCACTGGTCGTTGTTGTCTGTTGTCTGTTATGTTGTTTCGTGATGGCTCTAACTCTCCTCT-3'(SEQIDNO：1)。


2.根据权利要求1所述的适配体反蛋白石光子晶体传感材料，其中，步骤S1包括：把除氧后的100-150mL双蒸水、20-30mL甲基丙烯酸甲酯和0.2-0.4g过硫酸钾，在氮气气氛下间隔依次加入三口烧瓶中，以200-400r/min的速度搅拌，70-90℃水浴反应30-60min，反应结束后以不同的转速离心，制备得PMMA微球，放于4℃冰箱保存。


3.根据权利要求1所述的适配体反蛋白石光子晶体传感材料，其中，步骤S2包括：配制0.08-0.12M盐酸8-12mL，称取0.8-1.2g盐酸放于试管中，依次添加0.8-1.2g正硅酸乙酯和1-2g无水乙醇于试管内，将试管放在摇床上在室温下震荡孵育0.8-1.2h，即可获得TEOS溶液；先将载玻片浸泡在水虎鱼溶液中16-30h，之后用双蒸水和无水乙醇分别清洗，放入立式展缸中用氮气吹干；取TEOS溶液加入到PMMA微球悬浮液中...

【专利技术属性】
技术研发人员：彭媛，秦康，白家磊，高志贤，李双，韩殿鹏，任舒悦，王瑜，韩铁，李森，申慧婧，
申请(专利权)人：军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所，
类型：发明
国别省市：天津;12