槲皮素类化合物在保护丙烯酰胺引起的肝毒性中的应用制造技术

本发明专利技术涉及槲皮素类化合物在保护丙烯酰胺引起的肝毒性中的应用。本发明专利技术利用槲皮素、槲皮苷及金丝桃苷灌胃和AA处理小鼠，对肝脏进行氧化应激、自噬与凋亡相关蛋白表达检测，研究槲皮素类化合物对丙烯酰胺（AA）引起的肝毒性的体内保护机制。利用槲皮素、槲皮苷、槲皮素3‑β‑D‑葡萄糖苷及金丝桃苷预处理HepG2细胞，再用AA处理细胞，建立AA引起细胞自噬模型探究肝脏自噬发生下HepG2细胞变化，研究槲皮素类化合物的体外保护机制。本发明专利技术经研究证明槲皮素类化合物能通过影响细胞自噬、凋亡及氧化应激而对AA引起的肝损伤起到保护作用。本发明专利技术为解决AA引起的肝毒性提供一种思路，且为寻找更有效降低AA危害的槲皮素类化合物提供一定理论支持。

【技术实现步骤摘要】
槲皮素类化合物在保护丙烯酰胺引起的肝毒性中的应用
本专利技术涉及生物领域，具体涉及槲皮素类化合物在保护丙烯酰胺引起的肝毒性中的应用。
技术介绍
丙烯酰胺（AA）是食物在高于120℃的条件下加热形成的危害物，主要由天冬酰胺和还原糖通过美拉德反应产生，具有神经毒性、生殖毒性、肝脏毒性以及潜在的致癌性。肝脏是人体代谢的重要器官，研究发现，AA会引起肝脏发生病理学变化，影响肝脏功能，引起肝细胞损伤。因此，如何减弱AA对机体的毒性成为待解决的一大话题。AA的危害控制方法有很多，主要分为物理控制与化学控制。物理控制主要是通过改变反应条件进而改变AA生成量，这种方法具有高效、简便的特点，但是控制反应条件可能会影响美拉德反应中风味物质的生成。因此，使用化学添加物的方法备受关注。其中，植物来源的天然多酚具有来源广、危害小的特点，在减弱AA引起的毒性上备受关注，槲皮素类化合物是天然多酚的一种，它们以槲皮素作为苷元连接不同糖苷，具有抗氧化、抗炎及抗癌等药理学功能。然而，槲皮素类化合物是否能减弱AA引起肝脏毒性，以及具体作用机制尚未清楚。
技术实现思路
本专利技术的目的在于从体内和体外两方面提供槲皮素类化合物——槲皮素、槲皮苷、槲皮素3-β-D-葡萄糖苷及金丝桃苷在保护AA引起的肝毒性中的应用。本专利技术的技术方案如下所述。1.体内试验（1）动物试验：对昆明小鼠进行槲皮素、槲皮苷及金丝桃苷（10mg/kgbw/d）灌胃和AA处理；（2）检测蛋白表达：将不同处理组小鼠肝脏组织提取总蛋白，利用Westernblot对氧化应激、自噬和凋亡相关蛋白表达进行检测；（3）检测SOD、MDA：使用试剂盒对肝脏中超氧化物歧化酶（SOD）和脂质过氧化（MDA）水平进行检测；（4）检测LC3II：利用免疫荧光对LC3II进行标记。2.体外实验（1）细胞培养：人肝癌细胞HepG2购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，采用含10%胎牛血清和1%和青霉素-链霉素溶液（含青霉素100U/ml，链霉素100μg/ml）的MEM培养基培养，培养箱设置37℃、5%CO2；（2）细胞传代：待细胞长至皿底80%-90%时进行传代；（3）细胞处理：用无血清培养基溶解的槲皮素、槲皮苷、槲皮素-3-β-D-葡萄糖苷及金丝桃苷（20μM）处理细胞2h，再用无血清培养基溶解的AA（4mM）处理细胞24h；（4）检测蛋白表达：细胞处理后提取细胞蛋白，利用Westernblot对氧化应激、自噬和凋亡相关蛋白表达进行检测；（5）检测LC3II：利用免疫荧光对LC3II进行标记；（6）观察自噬体：利用透射电镜观察细胞中的自噬体；（7）检测MDA：使用试剂盒对细胞中脂质过氧化（MDA）水平进行检测；（8）检测线粒体膜电位变化：利用JC-1作为荧光探针，检测线粒体膜电位变化；（9）检测细胞凋亡：利用流式细胞术检测细胞凋亡。附图说明图1为不同处理组小鼠氧化应激相关蛋白表达。图2为不同处理组小鼠肝脏SOD与MDA含量变化。图3为不同处理组小鼠肝脏LC3转化水平。图4为不同处理组小鼠肝脏LC3免疫荧光。图5为不同处理组小鼠肝脏AKT/mTOR通路蛋白表达水平。图6为不同处理组小鼠肝脏自噬通路相关蛋白表达。图7为不同处理组小鼠肝脏线粒体凋亡通路相关蛋白表达。图8为不同处理组小鼠肝脏内质网应激介导的凋亡通路相关蛋白表达。图9为槲皮素类化合物对AA引起的HepG2细胞自噬相关蛋白表达的影响。图10为AA及槲皮素类化合物处理下HepG2细胞中LC3II免疫荧光标记。图11为AA及槲皮素类化合物处理下HepG2细胞透射电镜（a）对照组；（b）丙烯酰胺处理组；（c）槲皮素+丙烯酰胺处理组；（d）槲皮苷+丙烯酰胺处理组；（e）槲皮素-3-β-D-葡萄糖苷+丙烯酰胺处理组；（f）金丝桃苷+丙烯酰胺处理组。图12为AA及槲皮素类化合物处理下HepG2细胞ROS染色（a）对照组；（b）丙烯酰胺处理组；（c）槲皮素+丙烯酰胺处理组；（d）槲皮苷+丙烯酰胺处理组；（e）槲皮素-3-β-D-葡萄糖苷+丙烯酰胺处理组；（f）金丝桃苷+丙烯酰胺处理组。图13为槲皮素类化合物对AA引起HepG2细胞氧化应激相关蛋白表达的影响。图14为HepG2细胞中MDA含量变化。图15为AA及槲皮素类化合物处理下HepG2细胞JC-1染色。图16为槲皮素类化合物对AA引起的细胞凋亡相关蛋白的影响。图17为流式细胞术检测细胞凋亡。具体实施方式下面结合具体实施方式对本专利技术进行进一步的阐述说明，给出的实施例仅为了阐述本专利技术，而不是为了限制本专利技术的范围。实施例1：体内试验。（1）动物试验：将80只体重为25-30g的雄性昆明（KM）小鼠适应性饲养两周后，随机分成8组，每组10只，并按如下方式分组处理：A：control组，生理盐水灌胃14d；B：AA处理组，生理盐水灌胃7d后，50mg/kgbw/dAA腹腔注射7d；C：槲皮素+AA组，10mg/kgbw/d槲皮素灌胃7d；在第八天，10mg/kgbw/d槲皮素灌胃后，用50mg/kgbw/dAA腹腔注射7d；D：槲皮苷+AA组，10mg/kgbw/d槲皮苷灌胃7d；在第八天，10mg/kgbw/d槲皮苷灌胃后，用50mg/kgbw/dAA腹腔注射7d；E：金丝桃苷+AA组，10mg/kgbw/d金丝桃苷灌胃7d；在第八天，10mg/kgbw/d金丝桃苷灌胃后，用50mg/kgbw/dAA腹腔注射7d；F：槲皮素处理组，10mg/kgbw/d槲皮素灌胃14d；G：槲皮苷处理组，10mg/kgbw/d槲皮苷灌胃14d；H：金丝桃苷处理组，10mg/kgbw/d槲皮苷灌胃14d；试验期间每只小鼠可自由进食、饮水。在第15天牺牲小鼠。立即从小鼠中切除肝脏组织，并用冰冷的生理盐水彻底清洗。将各组织分为两部分，一部分用于固定于4%多聚甲醛中用于组织学观察，一部分用液氮速冻后转至-80℃冰箱保存备用。（2）组织蛋白提取：取冻存于-80℃的肝组织于2ml离心管中，按照1：20比例添加组织蛋白提取液，利用手持匀浆器在冰浴中匀浆。匀浆液置于4℃离心机中，12000r/min，离心5min。取上清液5μL，用组织蛋白提取液按照1：20比例稀释上清液，用于测定蛋白浓度。将牛血清白蛋白标准品（2mg/mL）稀释至1.5、1、0.5、0.2、0mg/mL，用于绘制标准曲线。将样品及标准品滴加96孔板中，设置四个平行孔（每孔5μL），将BCA的A、B液按50:1比例混合，快速滴加至96孔板（每孔100μL），放入37℃恒温箱中孵育30min，于490nm下测定吸光度值。根据测定的吸光度值，代入标准曲线，得出样品中蛋白浓度，利用组织蛋白提取液本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.槲皮素类化合物在保护丙烯酰胺（AA）引起的肝毒性中的应用。/n

【技术特征摘要】
1.槲皮素类化合物在保护丙烯酰胺（AA）引起的肝毒性中的应用。


2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述丙烯酰胺（AA）引起的肝毒性为氧化应激、细胞自噬和细胞凋亡。


3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述槲皮素类化合物的应用为体内（昆明小鼠）和体外（HepG2细胞）两方面。

【专利技术属性】
技术研发人员：陈琳，冯宪超，柴雨薇，雷雪莹，刘亚平，范小静，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：陕西;61