具有启动子活性的多核苷酸及其在生产目标化合物中的用途制造技术

本公开涉及具有启动子活性的多核苷酸及其在生产目标化合物中的用途，具体来说，本公开涉及具有启动子活性的多核苷酸，包含具有启动子活性的多核苷酸的转录表达盒、重组表达载体、重组宿主细胞，以及调控目标基因转录的方法、制备蛋白的方法和生产目标化合物的方法。本公开提供的具有启动子活性的多核苷酸是一种高盐、高渗透压诱导型的启动子，在盐浓度、渗透压升高的环境下具有增强的启动子活性。多核苷酸与目标基因可操作地连接，可以显著提高目标基因在高盐、高渗透压的胁迫环境下的表达强度，进而稳定、高效的生产下游产物，有效解决了当前添加IPTG等高昂诱导剂、且对菌株造成毒性的问题。

【技术实现步骤摘要】
具有启动子活性的多核苷酸及其在生产目标化合物中的用途
本公开属于生物技术和基因工程
，具体涉及一种具有启动子活性的多核苷酸，包含具有启动子活性的多核苷酸的转录表达盒、重组表达载体、重组宿主细胞，以及调控目标基因转录的方法、制备蛋白的方法和生产目标化合物的方法。
技术介绍
棒状杆菌，尤其是非致病的谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)，由于具有较强的氨基酸合成能力，是美国FDA认定的食品安全菌株，是目前发酵工业中最常使用的菌种之一，广泛用于蛋白、氨基酸、有机酸等化学品的工业化生产。目标基因的表达调控和优化是提高蛋白或产物合成的关键，而启动子元件则是调控基因表达的重要工具。目前，谷氨酸棒状杆菌中已经鉴定或开发了一系列的强启动子[1-2]或组成型启动子[3]，用于调控代谢途径中关键基因的表达。尽管上述启动子元件可以精细调控目标基因的表达，然而，对于一些毒性蛋白或代谢产物的合成，组成型启动子的使用还存在较大的限制。此外，强启动子或组成型启动子的表达往往对工程菌株也会造成较大的代谢负担。诱导型启动子可以控制转录起始的时间，因此更有利于菌株的代谢流调控和重新分配。目前tac、trc等诱导型启动子在谷氨酸棒状杆菌的代谢调控中被广泛使用。然而上述启动子往往需要额外添加昂贵的诱导剂，例如IPTG，这些诱导剂的添加也会对菌株造成一定的毒性，或对发酵体系造成较大的干扰。因此开发工业发酵条件下的自诱导系统对于工业菌株的构建至关重要。现阶段，已有研究报道了部分谷氨酸棒状杆菌中的自诱导启动子，例如赖氨酸诱导型启动子[4]、生长过程调控型启动子[5-6]等。但上述自诱导启动子的数量还相对较少，响应的条件也相对较窄，无法在更多的发酵体系和产物合成中普及应用。在发酵罐中pH和溶氧严格控制的条件下，利用谷氨酸棒状杆菌生产谷氨酸、赖氨酸等大宗化学品的产量能够达到100g/L甚至200g/L以上的水平[7-8]，因此，在发酵后期高浓度产物或中间代谢物的积累以及底物的不断流加势必引发高盐、高渗的压力。同时，高盐高渗条件也几乎是所有工业菌株在发酵后期都将面临的环境诱导因素[9]，目前，在谷氨酸棒状杆菌中，尚无高盐高渗诱导型启动子调控目标基因表达的应用先例。因此，鉴定高盐高渗诱导型启动子，开发构建针对发酵后期高盐高渗条件的自诱导系统，不仅可以增加可用的自诱导系统，而且可以为所有工业菌株的开发提供通用的自诱导元件，这也成为当前谷氨酸棒状杆菌工业菌株开发亟需解决的关键问题。引用文献：[1]CN101605890A.[2]Becker,J.,etal.,Metab.Eng.,2011,13,159-168.[3]Rytter,J.V.,etal.,Appl.Microbiol.Biotechnol.,2014,98,2617-2623.[4]CN101087881A.[5]Kim,M.J.,etal.,Appl.Microbiol.Biotechnol.,2016,100,4473-4483.[6]Ma,Y.C.,etal.,Microb.CellFact.,2018,17.[7]Xu,J.Z.,etal.,MicrobCellFact,2020,19,39.[8]户红通等,中国酿造,2018,37(10),51-56.[9]VarelaCetal.AppliedMicrobiologyAndBiotechnology2003,60(5):547-555.
技术实现思路
专利技术要解决的问题鉴于现有技术中存在的技术问题，例如，在工业发酵的过程中使用tac、trc等诱导型启动子需添加IPTG等昂贵诱导剂、且诱导剂的添加对菌株造成毒性的问题，为此，本公开提供了一种具有启动子活性的多核苷酸，前述多核苷酸在盐浓度、渗透压升高的环境下表现出增强的启动子活性。将多核苷酸与氨基酸合成相关的蛋白编码基因可操作的连接，可实现蛋白编码基因在高盐、高渗透压环境下的高效表达，有效解决了当前诱导型启动子需要添加高昂诱导剂、且诱导剂对菌株造成毒性的问题。用于解决问题的方案(1)一种具有启动子活性的多核苷酸，其中，所述多核苷酸选自如下(i)-(iv)中组成的组中的任一项：(i)包含如SEQIDNO：1-3任一序列所示的核苷酸序列；(ii)包含如SEQIDNO：1-3任一序列所示的核苷酸序列的反向互补序列；(iii)在高严格性杂交条件或非常高严格性杂交条件下，能够与(i)或(ii)所示的核苷酸序列杂交的序列的反向互补序列；(iv)与(i)或(ii)所示的核苷酸序列具有至少80％，可选至少90％，优选至少95％，更优选至少97％，更优选至少98％，最优选至少99％的序列同一性的序列。(2)根据(1)所述的具有启动子活性的多核苷酸，其中，所述多核苷酸在盐浓度或渗透压升高的环境中具有提高的启动子活性。(3)一种转录表达盒，其中，所述转录表达盒包含根据(1)或(2)所述的具有启动子活性的多核苷酸；可选地，所述转录表达盒还含有蛋白编码基因，所述蛋白编码基因与所述具有启动子活性的多核苷酸可操作地连接。(4)一种重组表达载体，其中，所述重组表达载体包含根据(1)或(2)所述的具有启动子活性的多核苷酸，或根据(3)所述的转录表达盒。(5)一种重组宿主细胞，其中，所述重组宿主细胞包含根据(3)所述的转录表达盒，或根据(4)所述的重组表达载体。(6)根据(5)所述的重组宿主细胞，其中，所述宿主细胞来源于棒状杆菌属、短杆菌属、节杆菌属、微杆菌属或埃希氏菌属；优选地，所述宿主细胞为谷氨酸棒杆菌或大肠杆菌；更优选地，所述宿主细胞为谷氨酸棒杆菌ATCC13032、谷氨酸棒杆菌ATCC13869或谷氨酸棒杆菌ATCC14067。(7)一种根据(1)或(2)所述的多核苷酸，根据(3)所述的转录表达盒，根据(4)所述的重组表达载体，根据(5)或(6)所述的重组宿主细胞在如下至少一种中的用途：(a)调控基因的转录水平，或制备用于调控基因的转录水平的试剂或试剂盒；(b)制备蛋白，或制备用于制备蛋白的试剂或试剂盒；(c)生产目标化合物，或制备用于生产目标化合物的试剂或试剂盒。(8)根据(7)所述的用途，其中，所述蛋白选自基因表达调控蛋白或与目标化合物合成相关的蛋白。(9)根据(7)或(8)所述的用途，其中，所述目标化合物包括氨基酸和有机酸中的至少一种；可选地，所述氨基酸包括赖氨酸、谷氨酸和苏氨酸中的至少一种，所述有机酸包括柠檬酸和琥珀酸中的至少一种。(10)一种调控目标基因转录的方法，其中，所述方法包括将(1)-(2)任一项所述的具有启动子活性的多核苷酸与目标基因可操作地连接的步骤。(11)一种制备蛋白的方法，其特征在于，包括利用根据(3)所述的转录表达盒，根据(4)所述的重组表达载体，或根据(5)-(6)任一项所述的重组宿主细胞表达所述蛋白的步骤；可选地，所本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种具有启动子活性的多核苷酸，其中，所述多核苷酸选自如下(i)-(iv)中组成的组中的任一项：/n(i)包含如SEQ ID NO：1-3任一序列所示的核苷酸序列；/n(ii)包含如SEQ ID NO：1-3任一序列所示的核苷酸序列的反向互补序列；/n(iii)在高严格性杂交条件或非常高严格性杂交条件下，能够与(i)或(ii)所示的核苷酸序列杂交的序列的反向互补序列；/n(iv)与(i)或(ii)所示的核苷酸序列具有至少80％，可选至少90％，优选至少95％，更优选至少97％，更优选至少98％，最优选至少99％的序列同一性的序列。/n

【技术特征摘要】
1.一种具有启动子活性的多核苷酸，其中，所述多核苷酸选自如下(i)-(iv)中组成的组中的任一项：
(i)包含如SEQIDNO：1-3任一序列所示的核苷酸序列；
(ii)包含如SEQIDNO：1-3任一序列所示的核苷酸序列的反向互补序列；
(iii)在高严格性杂交条件或非常高严格性杂交条件下，能够与(i)或(ii)所示的核苷酸序列杂交的序列的反向互补序列；
(iv)与(i)或(ii)所示的核苷酸序列具有至少80％，可选至少90％，优选至少95％，更优选至少97％，更优选至少98％，最优选至少99％的序列同一性的序列。


2.根据权利要求1所述的具有启动子活性的多核苷酸，其中，所述多核苷酸在盐浓度或渗透压升高的环境中具有提高的启动子活性。


3.一种转录表达盒，其中，所述转录表达盒包含根据权利要求1或2所述的具有启动子活性的多核苷酸；可选地，所述转录表达盒还含有蛋白编码基因，所述蛋白编码基因与所述具有启动子活性的多核苷酸可操作地连接。


4.一种重组表达载体，其中，所述重组表达载体包含根据权利要求1或2所述的具有启动子活性的多核苷酸，或根据权利要求3所述的转录表达盒。


5.一种重组宿主细胞，其中，所述重组宿主细胞包含根据权利要求3所述的转录表达盒，或根据权利要求4所述的重组表达载体。


6.根据权利要求5所述的重组宿主细胞，其中，所述宿主细胞来源于棒状杆菌属、短杆菌属、节杆菌属、微杆菌属或埃希氏菌属；优选地，所述宿主细胞为谷氨酸棒杆菌或大肠杆菌；更优选地，所述宿主细胞为谷氨酸棒杆菌ATCC13032、谷氨酸棒杆菌ATCC13869或谷氨酸棒杆菌ATCC14067。


7.一种根据权利要求1或2所述的多核苷酸，根据权利要求3所述的转录表达盒，根据权利要求4所述的重组表达载体，根据权利要求5或6所述的重组宿主细胞在如下至少一种中的用途：
(a)调控基因的转录水平，或制备用于调控基因的转录水平的试剂或试剂盒；
(b)制备蛋白，或制备用于制备蛋白的试剂或...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑平，陈久洲，黄婧文，孙际宾，周文娟，刘娇，马延和，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：天津;12