一种蛋白酶的精制和干燥方法技术

本发明专利技术公开了一种蛋白酶的精制和干燥方法，该方法是先用钠盐溶液对粗制蛋白酶原料进行提取，提高蛋白酶的溶解度，再加入絮凝剂对蛋白酶溶液中的杂质进行絮凝沉淀后去除，得到较为纯净的蛋白酶提取液，随后依次采用袋式过滤法和微滤过滤法进一步对蛋白酶提取液进行过滤净化，然后利用超滤进行浓缩、除盐，得到纯净的蛋白酶浓缩液，最后采用真空冷冻干燥机对蛋白酶浓缩液进行真空冷冻干燥。本发明专利技术中的蛋白酶精制方法简单、效率高，得到的蛋白酶纯度高、活性高且稳定，易于工业化生产。采用本发明专利技术的真空冷冻干燥方法及真空冷冻干燥机对蛋白酶浓缩液进行干燥，干燥速度快、能耗低、干燥率高，得到的蛋白酶产品酶活性高、酶活稳定性好、卫生质量好。

【技术实现步骤摘要】
一种蛋白酶的精制和干燥方法
本专利技术属于生物
，具体是一种蛋白酶的精制和干燥方法。
技术介绍
蛋白酶是水解蛋白质肽键的一类酶的总称，能够有效将大分子的蛋白质分解为多肽及游离氨基酸。蛋白酶催化肽键水解的特性，使其成为了常用的工业用酶之一，主要应用在食品、制革、日化、饲料及医药等行业，在肉类加工、洗涤、皮革制造、提高动物营养、制药等领域中都发挥着重要的作用。目前蛋白酶的生产大多是粗提取，酶活低、酶活稳定性不好、卫生质量较差，得到的蛋白酶产品级别低，因此，需要一种能得到酶活高、稳定性好、卫生质量好的蛋白酶的精制方法，同时该方法又适合大规模工业化生产。现有技术中常使用饱和硫酸铵溶液对蛋白酶进行盐析，将蛋白酶沉淀下来后经固液分离回收沉淀物得到蛋白酶。如专利申请CN103333873A中公开了②硫酸铵盐析：各取发酵液的离心上清液10L，边搅拌边缓慢添加经研磨过的硫酸铵粉末，使硫酸铵饱和度分别为30％～80％，缓慢搅拌20min后，4℃静置数小时。倾去上清液，5000r/min离心20min，取上清液测残余酶活，沉淀添加10～25mmol/LTris-HCl-CaCl2，pH8.0缓冲液溶解。专利CN200810231714.8中公开了(6)盐析：将硫酸铵晶体磨成粉末，在冰浴条件下边搅拌边加入pH为7.8的粗蛋白酶溶液中，然后继续搅拌1h放置于4℃条件下4000r/min离心30min，收集沉淀，溶于定量缓冲液中。专利CN91103165.0公开了取成熟健康的丝兰麻叶片3.2千克，刮取绿色栅状组织0.97千克，榨取汁410毫升。汁水离心（2000转/分），取上清水加一倍无离子水后，称取汁水量8%的硫酸铵，慢慢加入汁水中搅拌至溶，并继续搅拌10分钟，室温静置4小时后离心（2000转/分），取上清水再加到50%饱和度的硫酸铵盐析，静置12小时离心（2000转/分），收集沉淀物得酶液0.082千克。酶液经真空冷冻干燥得精酶0.043千克，用DHT-酪蛋白法测活性为51300μ/克。专利CN108949617B8公开了于0℃下向粗酶液中加入硫酸铵至浓度达到其饱和溶液摩尔浓度的60％，4℃静置12h后，在4℃、10000r/min离心15min取沉淀，用磷酸盐缓冲溶液(pH6.0)溶解沉淀，在4℃、10000r/min离心15min，回收上清液。上述步骤盐析后所得上清液经透析除盐，上样至预先用pH6.0、20mM磷酸盐缓冲液平衡好的阳离子交换层析柱Mono5/50GL，用含1mol/LNaCl磷酸盐缓冲液进行梯度洗脱，流速为1mL/min，分部收集并合并具有蛋白酶活性的组分。硫酸铵具有溶解度大、温度系数小、不易使蛋白质变性等特性，使得硫酸铵沉淀法是蛋白质粗分离时很重要的一种技术，但是硫酸铵也存在一定的缺陷。首先硫酸铵容易吸潮、使用量大，在使用前一般要先磨碎等，使得工业化生产时不好操作。其次使用硫酸铵进行盐析是利用盐析沉淀现象，使蛋白质溶解度降低后沉淀析出，在进行盐析之前还需要先对蛋白质进行净化，否则得到的蛋白质沉淀物中杂质多，而且很难使蛋白质的溶解度降至零，蛋白质的收率难以提高。再者作为食品添加剂的蛋白酶，如枯草芽孢杆菌蛋白、地衣芽孢杆菌蛋白酶等，提纯的产品中如含有硫酸铵，会影响后续的使用。生物酶通常有固体酶制剂及液体酶制剂两种。液体酶制剂因为酶在液体状态下容易失活保质期短，运输也不方便，所以一般对生物酶干燥后保存来延长其保质期。而且酶在高温条件下容易失活，因此在干燥时要注意温度，尽量让酶保持其活性不失活。现有技术通常采用喷雾干燥法、热风干燥法、真空冷冻干燥法、真空带式干燥法对液体酶制剂进行干燥。因真空冷冻干燥法能够很好地保护酶的活性，且干燥方法简单，真空冷冻干燥法又是液体酶制剂最常用的干燥方法，但现有的真空冷冻干燥机因存在进出料工作繁琐、隔层板温度不均匀、托盘导热不良好、冻干物料易受微生物污染等问题，容易影响物质真空冷冻干燥的效率、成本及产品质量。因此，如何对真空冷冻干燥机进行改进以提高其设备利用率也是生物酶加工工艺过程一个急需解决的问题。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种蛋白酶的精制和干燥方法，本专利技术的精制方法简单、高效且易于工业化生产，得到的蛋白酶纯度高、活性高且稳定。采用本专利技术的真空冷冻干燥方法及真空冷冻干燥机对蛋白酶浓缩液进行真空冷冻干燥，干燥速度快、能耗低、干燥率高，得到的蛋白酶酶活性高、酶活稳定性好、卫生质量好。本专利技术的技术方案如下：一种蛋白酶的精制和干燥方法，包括以下步骤：（1）在常温下，将粗制蛋白酶原料和水加入到提取罐中，再将钠盐完全溶于水制成溶液后加入到提取罐中，搅拌80～100min，结束后静置35～45min。其中，加料完毕后，混合液中粗制蛋白酶原料和水的重量比为1:15～20，钠盐的质量百分比为1～1.5%。（2）往步骤（1）得到的提取液中加入絮凝剂Ⅰ，静置絮凝8～12h；将上清液分离到储罐中；下浊液经搅拌均匀后送入离心机进行分离，回收分离液A。所述离心机优选卧式螺旋沉降离心机。（3）往分离液A中加入适量水进行稀释，再加入絮凝剂Ⅱ静置絮凝1～3h，将上清液分离到储罐中；下浊液经搅拌均匀后送入离心机进行离心分离，回收分离液B。所述离心机优选卧式螺旋沉降离心机。（4）再将分离液B用离心机进行分离，回收分离液C，对得到的分离液C和步骤（2）、（3）得到的上清液用袋式过滤器进行过滤，滤液再经过两级微滤过滤，回收微滤滤液经超滤进行浓缩、除盐，得到纯净的蛋白酶浓缩液。所述离心机优选管式离心机。超滤过程除去的盐可以回收处理并作为工业原料使用。（5）对真空冷冻干燥机的物料干燥舱及物料托盘进行消毒灭菌，将得到的蛋白酶浓缩液泵送至真空冷冻干燥机并均匀地分装在物料干燥舱内的物料托盘上，然后关闭并密封物料干燥舱，对蛋白酶浓缩液进行真空冷冻干燥，得到水分含量为1～5%的冻干蛋白酶。所述絮凝剂Ⅰ包括钠盐、钙盐；用量（质量百分比）为0.5～2%。所述絮凝剂Ⅱ包括钠盐、钙盐、聚丙烯酰胺；用量（质量百分比）为1～3%。絮凝剂的添加方法是：先将絮凝剂各成分分别溶于水中制成溶液，溶液的浓度为饱和浓度或者比饱和浓度稍低以确保使其完全溶解，溶液温度控制在30℃以下，再将钠盐溶液、钙盐溶液、聚丙烯酰胺溶液依次在缓慢搅拌下添加。絮凝过程温度控制在23℃以内。以上步骤（1）及絮凝剂中的钠盐是氯化钠、硫酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、硫代硫酸钠中一种以上。絮凝剂中的钙盐是氯化钙、硫酸钙中一种或者两种。所述真空冷冻干燥机包括物料干燥舱、捕水器、制冷装置、抽真空装置和加热装置，制冷装置、抽真空装置和加热装置均设在物料干燥舱和捕水器的外部；物料干燥舱和捕水器之间通过管道连接，并与制冷装置相互连接；加热装置与物料干燥舱连接，抽真空装置与捕水器连接。所述真空冷冻干燥机具体包括：包括进料泵、臭氧发生器、物料干燥舱、微波发生器、不冻液高位槽、冷热交换器、捕水器、放空阀、真空压力表、观察窗、真空调节装置、排水阀、罗茨真空泵、水环式真空泵、冷凝盘管、膨胀阀、电磁阀、循环泵、不冻本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种蛋白酶的精制和干燥方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：/n（1）在常温下，将粗制蛋白酶原料和水加入到提取罐中，再将钠盐完全溶于水制成溶液后加入到提取罐中，搅拌80～100min，结束后静置35～45min；其中，加料完毕后，混合液中粗制蛋白酶原料和水的重量比为1:15～20，钠盐的质量百分比为1～1.5%；/n（2）往步骤（1）得到的提取液中加入絮凝剂Ⅰ，静置絮凝8～12h；将上清液分离到储罐中；下浊液经搅拌均匀后送入离心机进行分离，回收分离液A；/n（3）往分离液A中加入适量水进行稀释，再加入絮凝剂Ⅱ静置絮凝1～3h，将上清液分离到储罐中；下浊液经搅拌均匀后送入离心机进行分离，回收分离液B；/n（4）再将分离液B用离心机进行分离，回收分离液C，对得到的分离液C和步骤（2）、（3）得到的上清液用袋式过滤器进行过滤，滤液再经过两级微滤过滤，回收微滤滤液经超滤进行浓缩、除盐，得到纯净的蛋白酶浓缩液；/n（5）对真空冷冻干燥机的物料干燥舱及物料托盘进行消毒灭菌，将得到的蛋白酶浓缩液用泵送至真空冷冻干燥机并均匀地分装在物料干燥舱内的物料托盘上，然后关闭并密封物料干燥舱，对蛋白酶浓缩液进行真空冷冻干燥，得到水分含量为1～5%的冻干蛋白酶。/n...

【技术特征摘要】
1.一种蛋白酶的精制和干燥方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
（1）在常温下，将粗制蛋白酶原料和水加入到提取罐中，再将钠盐完全溶于水制成溶液后加入到提取罐中，搅拌80～100min，结束后静置35～45min；其中，加料完毕后，混合液中粗制蛋白酶原料和水的重量比为1:15～20，钠盐的质量百分比为1～1.5%；
（2）往步骤（1）得到的提取液中加入絮凝剂Ⅰ，静置絮凝8～12h；将上清液分离到储罐中；下浊液经搅拌均匀后送入离心机进行分离，回收分离液A；
（3）往分离液A中加入适量水进行稀释，再加入絮凝剂Ⅱ静置絮凝1～3h，将上清液分离到储罐中；下浊液经搅拌均匀后送入离心机进行分离，回收分离液B；
（4）再将分离液B用离心机进行分离，回收分离液C，对得到的分离液C和步骤（2）、（3）得到的上清液用袋式过滤器进行过滤，滤液再经过两级微滤过滤，回收微滤滤液经超滤进行浓缩、除盐，得到纯净的蛋白酶浓缩液；
（5）对真空冷冻干燥机的物料干燥舱及物料托盘进行消毒灭菌，将得到的蛋白酶浓缩液用泵送至真空冷冻干燥机并均匀地分装在物料干燥舱内的物料托盘上，然后关闭并密封物料干燥舱，对蛋白酶浓缩液进行真空冷冻干燥，得到水分含量为1～5%的冻干蛋白酶。


2.根据权利要求1所述蛋白酶的精制和干燥方法，其特征在于，所述絮凝剂Ⅰ包括钠盐、钙盐；所述絮凝剂Ⅱ包括钠盐、钙盐、聚丙烯酰胺。


3.根据权利要求2所述蛋白酶的精制和干燥方法，其特征在于，絮凝剂的添加方法是：先将絮凝剂各成分分别溶于水中制成溶液，溶液温度控制在30℃以下，再将钠盐溶液、钙盐溶液、聚丙烯酰胺溶液依次在缓慢搅拌下添加；絮凝过程温度控制在23℃以内。


4.根据权利要求1所述蛋白酶的精制和干燥方法，其特征在于，所述真空冷冻干燥机包括物料干燥舱、捕水器、制冷装置、抽真空装置和加热装置，制冷装置、抽真空装置和加热装置均设在物料干燥舱和捕水器的外部；物料干燥舱和捕水器之间通过管道连接，并与制冷...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘汉灵，刘研，梁智，曾吉伟，黄菊，
申请(专利权)人：广西叁万生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广西;45