一种脂肪间充质干细胞工作细胞库的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种脂肪间充质干细胞工作细胞库的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)无菌采集人体脂肪；(2)胶原酶消化；(3)脂肪间充质干细胞分离与原代培养(4)脂肪间充质干细胞传代培养；(5)干细胞冻存；(6)干细胞质量检验；(7)干细胞入库。脂肪间充质干细胞是存在于脂肪组织的成体多潜能干细胞，在一定条件下可分化为骨、软骨、心肌、平滑肌、神经及内皮等多种组织细胞，并且脂肪组织来源丰富，体内的储备量大，取材相对容易，少量组织即可以获得大量的干细胞，衰亡率低等优势，因此建立脂肪间充质干细胞工作细胞库能够为细胞治疗提供良好的、充足的细胞来源，为临床应用提供潜在的应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种脂肪间充质干细胞工作细胞库的制备方法
本专利技术涉及一种工作细胞库的制备方法，具体涉及一种脂肪间充质干细胞工作细胞库的制备方法。
技术介绍
间充质干细胞(MesenchymalStemCells，MSCs)是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层和外胚层。间充质干细胞最初在骨髓中发现，因其具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注。间充质干细胞在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复。脂肪间充质干细胞(AdiposeMesenchymalStemCells,ADSC)是存在于脂肪组织的成体多潜能干细胞，在一定条件下可分化为骨、软骨、心肌、平滑肌、神经及内皮等多种组织细胞。由于脂肪组织来源丰富，体内的储备量大，取材相对容易，少量组织即可以获得大量的干细胞，衰亡率低等优势，因此人脂肪间充质干细胞在临床上具有很高的应用价值。干细胞工作库就是将干细胞置于深低温状态下长期保存，一个完善的干细胞工作细胞库能够为临床细胞治疗提供良好的、充足的细胞来源。目前，国内已经建立了人脐带干细胞库，胎盘干细胞库、骨髓干细胞库，但对于脂肪间充质干细胞工作细胞库的构建和制备的相关研究较少，技术不够成熟。
技术实现思路
为了克服现有技术的不足，提供了一种脂肪间充质干细胞工作细胞库的制备方法，能够为脂肪间充质干细胞的临床应用提供价值。为了实现上述目的，本专利技术采取的技术方案如下：一种脂肪间充质干细胞工作细胞库的制备方法，包括以下步骤：(1)无菌采集人体脂肪；(2)胶原酶消化；(3)脂肪间充质干细胞分离与原代培养；(4)脂肪间充质干细胞传代培养；(5)脂肪间充质干细胞冻存；(6)脂肪间充质干细胞质量检验；(7)脂肪间充质干细胞入库。作为一种优选的方案，所述无菌采集脂肪之后需要进行油脂去除处理，首先将脂肪组织转入离心管中，加入质量分数为0.9％的氯化钠注射液洗涤，离心后分层，收集上层脂肪组织并用质量分数为0.9％的氯化钠注射液洗涤4-6次。作为一种优选的方案，所述脂肪间充质干细胞分离与原代培养包括以下步骤：(1)用无血清培养体系重悬细胞，接种培养至恒温恒湿CO2培养箱中；(2)24-48h后，观察细胞生长情况，若看到30％及以上的梭状细胞贴壁可进行半量换液；；(3)后续每隔2-3天全量换液；(4)培养至5-7天可观察到贴壁细胞融合度达到80％及以上，则可进行收获传代至工作库细胞冻存。作为一种优选的方案，所述培养箱的条件为温度37℃、5％CO2、湿度94～96％。作为一种优选的方案，所述传代培养的传代完成的标志为细胞融合度达到80％。作为一种优选的方案，所述干细胞冻存用的冻存保护液包括：DMSO10v/v％-20v/v％、培养基40v/v％-50v/v％、人血清白蛋白40v/v％-50v/v％。作为一种优选的方案，所述培养基无血清，包括基础培养基、重组胰岛素、重组生长因子、人血白蛋白、转铁蛋白。作为一种优选的方案，所述基础培养基为低糖型DMEM培养基、高糖型DMEM培养基、无血清无酚红MEM培养基中的一种。作为一种优选的方案，所述干细胞质量检验项目包括：细胞形态、细胞数量、细胞活率、微生物检测、支原体、内毒素、病毒检测、端粒酶活性、细胞表型、STR图谱、染色体核型、三系分化能力、免疫学反应。作为一种优选的方案，所述病毒检测包括ABO/RH血型分型、HLA分型、HIV、HBV、HCV、TP检测。有益效果：(1)本专利技术提供了一种脂肪间充质干细胞工作细胞库的制备方法，可以将干细胞在深低温状态下长期保存，可以为临床细胞治疗提供良好的、充足的细胞来源。(2)干细胞的冻存保护液包括40v/v％-50v/v％的人血白蛋白和DMSO10v/v％-20v/v％，能够提高脂肪间充质干细胞冻存的存活稳定性和细胞复苏率，减少冻存过程中冰晶的形成，通过人血白蛋白和DMSO协同作用可以减少细胞冻存和复苏过程中温度的剧烈变化对细胞的损害。(3)干细胞的冻存保护液采用无血清培养基，不含有非人源的血清或蛋白，防止引入外源性污染和过敏原，避免引起不良反应，还能够提高冻存后脂肪间充质干细胞的活率，并保持良好的干细胞特性。(4)采用重组胰岛素、人血白蛋白和转铁蛋白替代血清，能够保证脂肪间充质干细胞在冻存环境中的活性，维持细胞生长和增殖，同时加入了重组生长因子，在冻存过程中减少对细胞的损伤，保证细胞的存活率和复苏后细胞的分化能力。(5)干细胞工作库的制备方法中包括干细胞的质量检验，通过对脂肪间充质干细胞入库前的全检，确保工作库细胞符合质量标准。具体实施方式结合以下本专利技术的优选实施方法的详述以及包括的实施例可进一步地理解本专利技术的内容。除非另有说明，本文中使用的所有技术及科学术语均具有与本专利技术所属领域普通技术人员的通常理解相同的含义。如果现有技术中披露的具体术语的定义与本专利技术中提供的任何定义不一致，则以本专利技术中提供的术语定义为准。在本文中使用的，除非上下文中明确地另有指示，否则没有限定单复数形式的特征也意在包括复数形式的特征。还应理解的是，如本文所用术语“由…制备”与“包含”同义，“包括”、“包括有”、“具有”、“包含”和/或“包含有”，当在本说明书中使用时表示所陈述的组合物、步骤、方法、制品或装置，但不排除存在或添加一个或多个其它组合物、步骤、方法、制品或装置。此外，当描述本专利技术的实施方式时，使用“优选的”、“优选地”、“更优选的”等是指，在某些情况下可提供某些有益效果的本专利技术实施方案。然而，在相同的情况下或其他情况下，其他实施方案也可能是优选的。除此之外，对一个或多个优选实施方案的表述并不暗示其他实施方案不可用，也并非旨在将其他实施方案排除在本专利技术的范围之外。为了实现上述目的，本专利技术提供了一种脂肪间充质干细胞工作细胞库的制备方法，包括以下步骤：(1)无菌采集人体脂肪；(2)胶原酶消化；(3)脂肪间充质干细胞分离与原代培养；(4)脂肪间充质干细胞传代培养；(5)脂肪间充质干细胞冻存；(6)脂肪间充质干细胞质量检验；(7)脂肪间充质干细胞入库。在一些优选的实施方式中，在无菌环境下采集人体腹部皮下脂肪组织，然后进行油脂去除处理，首先将脂肪组织转入离心管中，加入质量分数为0.9％的氯化钠注射液洗涤，离心后分层，收集上层脂肪组织并用质量分数为0.9％的氯化钠注射液洗涤4-6次。向脂肪组织中加入等体积的胶原酶消化，37℃水浴消化20-30min，加入等体积的完全培养基终止酶解消化，然后进行离心5-10min，移除上层清液和悬浮的残余组织，收集下层部分。所述胶原酶是I型胶原酶，所述I型胶本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种脂肪间充质干细胞工作细胞库的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：/n(1)无菌采集人体脂肪；/n(2)胶原酶消化；/n(3)脂肪间充质干细胞分离与原代培养；/n(4)脂肪间充质干细胞传代培养；/n(5)脂肪间充质干细胞冻存；/n(6)脂肪间充质干细胞质量检验；/n(7)脂肪间充质干细胞入库。/n

【技术特征摘要】
1.一种脂肪间充质干细胞工作细胞库的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)无菌采集人体脂肪；
(2)胶原酶消化；
(3)脂肪间充质干细胞分离与原代培养；
(4)脂肪间充质干细胞传代培养；
(5)脂肪间充质干细胞冻存；
(6)脂肪间充质干细胞质量检验；
(7)脂肪间充质干细胞入库。


2.根据权利要求1所述的一种脂肪间充质干细胞工作细胞库的制备方法，其特征在于，所述无菌采集脂肪之后需要进行油脂去除处理，包括：首先将脂肪组织转入离心管中，加入质量分数为0.9％的氯化钠注射液，离心后分层，收集上层脂肪组织并用质量分数为0.9％的氯化钠注射液反复洗涤4-6次。


3.根据权利要求1所述的一种脂肪间充质干细胞工作细胞库的制备方法，其特征在于，所述脂肪间充质干细胞分离与原代培养包括以下步骤：(1)用无血清培养体系重悬细胞，接种培养至恒温恒湿CO2培养箱中；(2)24-48h后，观察细胞贴壁情况，若看到30％及以上的梭状细胞贴壁可进行半量换液；(3)后续每隔2-3天全量换液；(4)培养至5-7天可观察到贴壁细胞融合度达到80％及以上，则可进行收获传代至工作库细胞冻存。


4.根据权利要求3所述的一种脂肪间充质干细胞工作细胞库的制备方法，其特征在于，所述培养箱的条件为温度37℃、5％CO2，湿度94～96％。

【专利技术属性】
技术研发人员：朱灏，
申请(专利权)人：达瑟儿上海生命科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31